ATP6V0D2通过调控铁死亡相关信号通路促进动脉粥样硬化相关血管平滑肌细胞功能障碍

《The Journal of Gene Medicine》：ATP6V0D2 Promotes Atherosclerosis-Associated Vascular Smooth Muscle Cell Dysfunction by Modulating Ferroptosis-Related Signaling

　　

背景：动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是心血管疾病发病率和死亡率的重要基础，然而驱动血管细胞损伤的分子事件仍仅部分明确。方法：研究人员首先比较了载脂蛋白E缺陷（apolipoprotein E-deficient, ApoE^?/?）小鼠在对照饮食或高脂饮食下的主动脉转录组（aortic transcriptome）。随后，在受到氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL）刺激的人血管平滑肌细胞（human vascular smooth muscle cells, HVSMCs）中检测了候选基因效应。结果：主动脉数据集包含2832个差异表达基因（1800个上调，1032个下调）。在筛选出的5个基因中，ATP6V₀D₂随着ox-LDL浓度升高而呈现梯度增加。网络与富集结果将ATP6V₀D₂与质子移动、细胞内细胞器酸化和铁转运相关联。沉默ATP6V₀D₂限制了ox-LDL诱发的中性脂质积累，并抑制了细胞周期进入、运动和侵袭。在分子水平上，敲低降低了长链脂酰辅酶A合成酶家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, ACSL₄），并恢复了溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX₄）。敲低还提高了谷胱甘肽（glutathione, GSH）丰度和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性，同时降低了丙二醛（malondialdehyde, MDA）、活性氧（reactive oxygen species, ROS）、线粒体收缩和嵴损伤。Ferrostatin-1使分子、氧化还原和超微结构读数向相同方向变化。结论：这些数据确定ATP6V₀D₂是ox-LDL诱导的HVSMCs异常表型的促成因子。其耗竭似乎部分通过减弱与铁死亡一致的变化来抑制该反应，并值得作为AS的机制靶点进行进一步评估。

动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是多种心血管疾病的共同病理基础，也是全球范围内致死致残的主要原因。尽管脂质蓄积、慢性炎症、内皮功能障碍和氧化应激等机制已被证实参与AS的发生发展，驱动血管壁细胞损伤的分子网络仍未完全阐明。V-ATPase（vacuolar H+-ATPase，液泡H+三磷酸腺苷酶）通过ATP水解驱动跨膜质子转运，维持细胞内区室的酸性环境。其V₀结构域的d2亚基由ATP6V₀D₂基因编码，已知参与破骨细胞介导的细胞外酸化、宿主防御、过敏炎症和肿瘤生物学，但该酸化机制是否参与AS中平滑肌细胞功能障碍此前尚无报道。铁死亡（ferroptosis）是一种依赖铁离子的膜脂质过氧化驱动的新型调节性细胞死亡方式，其经典保护通路依赖SLC7A11（溶质载体家族7成员11）摄取胱氨酸以维持GSH（谷胱甘肽）合成，并由GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）解毒磷脂氢过氧化物；而ACSL4（长链脂酰辅酶A合成酶家族成员4）则通过富集多不饱和脂肪酸增加膜脂氧化易感性。已有证据提示铁死亡相关氧化还原失衡参与AS病变中的内皮、巨噬细胞和平滑肌细胞损伤。然而，ATP6V₀D₂依赖的细胞器酸化与VSMC铁死亡反应之间的机制关联尚属空白。此外，VSMC在斑块内呈现高度表型可塑性，可向成纤维样、炎症样或巨噬细胞样细胞转化，其存活与死亡路径直接影响纤维帽完整性和坏死核心发展。基于此，研究人员提出ATP6V₀D₂可能通过铁死亡相关信号参与AS中VSMC功能障碍的假说。

为验证该假说，研究人员首先利用载脂蛋白E基因敲除（ApoE^?/?）小鼠模型，通过高脂饮食喂养16周诱导AS，并对主动脉组织进行RNA测序（RNA-seq）；随后在ox-LDL刺激的人血管平滑肌细胞（HVSMCs）中，采用小干扰RNA（siRNA）敲低ATP6V₀D₂，综合评价脂质蓄积、细胞周期、迁移侵袭、氧化应激指标、铁死亡相关蛋白表达及线粒体超微结构变化，并以铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）进行平行验证，以此解析其潜在机制。

研究人员开展的研究取得了明确的发现：主动脉转录组分析共鉴定出2832个差异表达基因（DEGs），其中1800个上调、1032个下调；候选基因验证显示ATP6V₀D₂在ox-LDL处理下显著上调且呈浓度梯度依赖，而GDF3、ACOD1、GPNMB和HAVCR2均下调。GO（基因本体）、KEGG（京都基因与基因组百科全书）通路富集和蛋白-蛋白相互作用网络分析将ATP6V₀D₂与质子转运、细胞器酸化和铁转运相关联。功能研究表明，敲低ATP6V₀D₂可显著抑制ox-LDL诱导的中性脂质蓄积、G0/G1→S期细胞周期进入、迁移和侵袭能力；分子水平上，敲低降低ACSL4并上调SLC7A11和GPX4，同时提高GSH含量和SOD活性，降低MDA、ROS水平并减轻线粒体收缩和嵴破坏；Fer-1处理呈现方向一致的效应，进一步支持铁死亡通路参与其中。这些发现首次将ATP6V₀D₂与ox-LDL诱导的VSMC铁死亡相关信号联系起来。

以下按论文小标题概述主要结果。3.1 主动脉转录组可区分AS组与对照组：通过高脂饮食喂养ApoE^?/?小鼠，RNA-seq共鉴定出2832个DEGs，火山图和聚类分析显示AS组与对照组转录谱显著分离，GO和KEGG富集分析揭示了与AS相关的生物过程和信号通路。3.2 QRT-PCR检测5个候选DEGs：在ox-LDL诱导的HVSMCs中对ATP6V₀D₂、GDF3、ACOD1、GPNMB和HAVCR2进行qRT-PCR验证，结果显示ATP6V₀D₂显著上调，且其mRNA和蛋白水平随ox-LDL浓度（0–100 μg/mL）升高呈梯度上升。3.3 ATP6V₀D₂的互作网络和富集图谱：PPI网络包含51个节点节点，富集分析显示其参与pH降低、三价铁和转铁蛋白转运、吞噬体酸化、液泡膜和质子转运V型ATP酶复合体等组分，以及突触囊泡循环和集合管酸分泌等通路。3.4 ATP6V₀D₂敲低减少脂质蓄积和细胞周期进展：油红O染色显示敲低显著减少ox-LDL诱导的脂滴积累；流式细胞术显示敲低使G0/G1期细胞比例增加、S期减少，表明其可抑制细胞周期进入和增殖相关反应。3.5 ATP6V₀D₂敲低抑制HVSMC迁移和侵袭：划痕愈合实验和Transwell实验均显示，ox-LDL显著增强HVSMC迁移和侵袭能力，敲低ATP6V₀D₂后这些能力明显下降。3.6 ATP6V₀D₂敲低改变铁死亡相关蛋白表达：Western blot和qRT-PCR显示，敲低降低ACSL4，同时升高SLC7A11和GPX4，呈现恢复细胞抗氧化防御的趋势。3.7 敲低减轻氧化应激和线粒体超微结构损伤：敲低提高GSH和SOD活性，降低MDA和ROS阳性细胞比例，透射电镜显示线粒体萎缩和嵴断裂明显减轻；Fer-1处理在上述氧化指标和线粒体形态上产生方向一致的效果，并同时下调ACSL4、上调GPX4和SLC7A11。

讨论部分指出，ATP6V₀D₂的选择基于其可重复的上调模式、心血管相关性及在生物信息学分析中的中心位置，而非仅依赖表达倍数变化。既往研究报道ATP6V₀D₂与急性冠脉综合征和慢性冠心病的易感性增加相关，支持其心血管病理意义。本研究的发现表明，ATP6V₀D₂敲低通过抑制ACSL4相关的脂质过氧化并恢复SLC7A11/GSH/GPX4抗氧化轴来保护HVSMCs抵抗ox-LDL诱导的损伤。研究局限包括：仅使用单一ox-LDL处理的HVSMC模型，缺乏内皮细胞、巨噬细胞和免疫细胞相互作用的整合；未进行SLC7A11或GPX4的遗传上位或补救实验；ApoE^?/?小鼠仅用于转录组发现，未进行体内ATP6V₀D₂功能获得或缺失研究；独立临床队列证据仍待获取。研究结论为：ATP6V₀D₂在AS细胞模型中高表达；敲低ATP6V₀D₂可抑制脂质蓄积、细胞增殖、迁移和侵袭，其机制涉及SLC7A11/GPX4通路；该分子在AS发生发展中发挥关键作用，值得作为候选调节因子进一步深入研究。