《Life Sciences》：Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide induces osteoblast senescence and defective mineralization associated with indoleamine 2,3-dioxygenase 1–kynurenine–aryl hydrocarbon receptor signaling
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摘要目的本研究旨在探讨来自牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）的脂多糖（P.g-LPS）是否与成骨细胞衰老及矿化缺陷有关，以及这些现象是否涉及炎症相关的吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）– 酪氨酸尿素（Kyn）– 芳烃受体（AhR）通路，并探究其上游调控机制。方法将hF
摘要
目的
本研究旨在探讨来自牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）的脂多糖（P.g-LPS）是否与成骨细胞衰老及矿化缺陷有关，以及这些现象是否涉及炎症相关的吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）– 酪氨酸尿素（Kyn）– 芳烃受体（AhR）通路，并探究其上游调控机制。
方法
将hFOB1.19人类成骨细胞和斑马鱼暴露于P.g-LPS中。通过染色、qPCR、Western blotting、ELISA、基因沉默和双荧光素酶报告基因检测等方法，评估成骨分化、细胞衰老、IDO1/Kyn/AhR信号通路、Toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）/RELAP介导的调控机制，以及IDO1抑制剂epacadostat和AhR抑制剂CH223191对这些过程的干预效果。
结果
P.g-LPS降低了hFOB1.19细胞和斑马鱼的成骨分化和矿化能力，并增加了与衰老相关的标志物表达。P.g-LPS增加了IDO1的表达和Kyn的水平；epacadostat可以缓解这种损伤和衰老相关变化。外源性Kyn能增强AhR响应基因的表达并产生类似表型，而CH223191则能抑制这些效应。TLR4基因敲低显著减少了P.g-LPS诱导的IDO1、NFKB1和RELAP的表达；RELAP的过表达会增强野生型IDO1启动子的活性，但在NF-κB结合位点发生突变后这种效应消失。
结论
P.g-LPS引起的成骨功能障碍和衰老相关变化涉及IDO1–Kyn–AhR信号通路，同时也涉及TLR4相关的反应和RELAP依赖的IDO1启动子活性。抑制IDO1或AhR可以在实验模型中缓解这些现象。
引言
牙周炎是一种慢性炎症性疾病，其特征是生物膜的失衡、宿主反应异常以及进行性的牙槽骨丢失[1],[2]。除了破骨细胞活性增强外，成骨细胞的持续炎症抑制也会导致骨重塑失衡。细胞衰老会进一步损害再生能力，因为衰老细胞虽然失去了增殖和分化能力，但会通过分泌型表型维持局部炎症[3],[4],[5]。衰老会加剧对牙龈卟啉单胞菌及其毒力因子的牙周反应，从而加重牙槽骨吸收[6],[7]。
牙龈卟啉单胞菌是主要的牙周病原体。其脂多糖（P.g-LPS）通过Toll样受体4（TLR4）、核因子κB（NF-κB）、氧化应激及其他成骨调节因子介导的途径抑制成骨基因表达、碱性磷酸酶活性和基质矿化[8],[9],[10],[11]。P. gingivalis还可以改变局部色氨酸相关的代谢环境[12]，表明炎症刺激和代谢重塑可能共同导致牙周骨损伤。目前尚不清楚P.g-LPS是否通过特定的代谢途径驱动成骨细胞衰老和矿化缺陷。
吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）是色氨酸–酪氨酸尿素代谢途径中的限速酶，在慢性炎症和衰老过程中被激活[13],[14]。牙周炎与色氨酸–酪氨酸尿素代谢紊乱相关，炎症细胞因子或Toll样受体激动剂可诱导牙周来源细胞中的IDO1表达[15],[16],[17],[18]。酪氨酸尿素（Kyn）作为IDO1的代谢产物和内源性芳烃受体（AhR）配体，可促进细胞衰老并损害成骨潜能，而异常的AhR激活也可能促进破骨细胞的生成[19],[20],[21],[22],[23]。尽管炎症对成骨作用和Kyn/AhR相关骨骼衰老的抑制作用已分别得到研究，但它们在P.g-LPS暴露的成骨细胞中的潜在联系仍不明确。
因此，我们研究了TLR4/RELAP相关的反应和IDO1–Kyn–AhR通路是否参与了P.g-LPS引起的成骨功能障碍和衰老相关变化。这一假设通过在hFOB1.19成骨细胞和斑马鱼中应用药物抑制、基因沉默及启动子报告基因检测进行了验证。
章节片段
细胞培养与成骨诱导
hFOB1.19人类成骨细胞（ATCC）在含有10%胎牛血清和0.3 mg/mL G418（Beyotime，中国）的DMEM/Ham's F-12培养基中培养，培养条件为34°C和5% CO?。细胞在80–90%汇合度时使用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行传代。
为了诱导成骨分化，将汇合度为70–80%的细胞转移到39.5°C的培养基中，继续培养7天，培养基中加入10 mM β-甘油磷酸、50 μg/mL L-抗坏血酸和100 nM地塞米松；每2天更换一次培养基。
P.g-LPS抑制成骨细胞分化并诱导衰老相关变化
CCK-8分析显示，当P.g-LPS浓度超过400 ng/mL时，hFOB1.19细胞中的CCK-8信号强度降至80%以下；因此选择400 ng/mL作为高浓度，100 ng/mL和200 ng/mL作为后续实验的低浓度（图1A）。茜素红S和ALP染色显示矿化区域和ALP阳性区域的面积随浓度增加而减少（图1B–E）。200 ng/mL和400 ng/mL的P.g-LPS还降低了RUNX2、SP7和BGLAP的mRNA表达（图1F–H）。
讨论
本研究将P.g-LPS引起的成骨功能障碍与IDO1–Kyn–AhR相关的代谢和衰老相关变化联系起来，扩展了先前关于炎症性成骨障碍和Kyn/AhR相关骨骼衰老的研究。在hFOB1.19细胞中，P.g-LPS抑制了成骨分化，增加了与衰老相关的标志物表达，并提高了IDO1的表达和细胞外Kyn的水平。IDO1的抑制缓解了这些变化，而外源性Kyn则激活了AhR响应基因。
结论
P.g-LPS引起的成骨功能障碍和衰老相关变化伴随着IDO1表达的增加、Kyn的积累以及AhR响应信号的增强，TLR4/RELAP的调控可能对此有所贡献。抑制IDO1或AhR可以减轻细胞和斑马鱼中的骨骼形成障碍和衰老相关表型，这表明IDO1–Kyn–AhR通路在这些过程中发挥了作用。
CRediT作者贡献声明
韩曙光：负责原始稿撰写、可视化处理、方法研究、数据分析、概念构思。张文龙：负责原始稿撰写、可视化处理、验证、方法研究、数据分析。张晓莉：负责验证、数据分析。王明勇：负责稿件修订与编辑、验证、项目监督、方法研究、概念构思。姜宇：负责稿件修订与编辑、验证。
伦理声明
所有涉及斑马鱼的实验均经过Murui生物技术有限公司实验动物福利与伦理委员会的审查和批准（批准编号：MR20260513006）。所有动物实验均遵循ARRIVE指南以及相关机构和国家的实验室动物护理和使用规范。实验中使用成年雄性和雌性斑马鱼，比例为1:1。胚胎和幼鱼的性别未进行鉴定。
动物实验
本实验遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。实验获得了Murui生物技术有限公司实验动物福利与伦理委员会的批准（批准编号：MR20260513006）。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在撰写本文过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来提升文本的语言表达和可读性。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审核和修改，并对最终发表的内容承担全部责任。
资助
本研究得到了江苏省卫生健康委员会医疗研究项目的支持（编号：Z2022027）。
利益冲突声明
作者声明以下可能的利益冲突：姜宇表示接受了江苏省卫生健康委员会医疗研究项目的财务支持；王明勇与Murui生物技术有限公司存在雇佣关系。其他作者无利益冲突。
韩曙光|张文龙|张晓莉|王明勇|姜宇
