虎杖苷通过NRIP2/NRF2轴调控铜稳态与铜死亡改善IL-4/TGF-β诱导的支气管上皮细胞损伤

《Letters in Drug Design & Discovery》：Polydatin attenuates IL-4/TGF-β-induced bronchial epithelial cell injury by modulating copper homeostasis and cuproptosis via NRIP2/NRF2 axis

　　

背景：铜死亡（cuproptosis）诱导的支气管上皮细胞（bronchial epithelial cell, BEC）损伤近期被确定为慢性哮喘气道重塑的新调节因素。虎杖苷（Polydatin）是一种天然抗氧化剂；然而，虎杖苷是否通过调节铜死亡发挥抗哮喘作用仍未知。本研究旨在探讨虎杖苷对重组人白细胞介素-4（recombinant human interleukin-4, rhIL-4）/转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）诱导的BEC损伤的保护作用及其涉及铜稳态和铜死亡的潜在机制。方法：通过rhIL-4（20 ng/mL）和TGF-β（5 ng/mL）刺激BEAS-2B细胞48 h建立BEC损伤体外模型。对于虎杖苷干预，细胞与50 μM虎杖苷同时与rhIL-4/TGF-β共处理。测定细胞活力、细胞迁移、细胞内铜水平以及细胞内和线粒体活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平。此外，通过定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和western blot检测参与铜稳态的基因和铜死亡标志物的表达水平。利用生物信息学分析和核受体相互作用蛋白2（nuclear receptor-interacting protein 2, NRIP2）/核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2）轴敲低实验，研究NRIP2/NRF2轴作为虎杖苷的潜在靶点。结果：虎杖苷显著减轻rhIL-4/TGF-β处理后的BEC损伤，表现为细胞活力和迁移恢复。细胞内铜水平和ROS水平在rhIL-4/TGF-β处理后显著升高，可被虎杖苷大幅缓解。一致地，铜输出蛋白（ATP7A和ATP7B）表达以及铜死亡标志物（FDX1和DLST）表达被虎杖苷缓解。此外，NRIP2/NRF2轴被确定为虎杖苷的潜在靶点。瞬时敲低NRIP2显著抑制NRF2表达。此外，NRIP2和NRF2表达模式被rhIL-4/TGF-β明显抑制，可被虎杖苷消除。结论：虎杖苷通过激活NRIP2/NRF2轴恢复铜稳态并抑制铜死亡，保护BEC免受rhIL-4/TGF-β诱导的损伤。本研究为虎杖苷作为潜在治疗候选药物提供了新的机制基础，尽管结论限于支气管上皮细胞损伤的体外模型。应注意，本研究使用体外BEAS-2B单层模型，结论限于保护上皮细胞损伤和抑制铜死亡标志物，而非在体内逆转气道重塑。

研究背景与问题：哮喘是最常见的慢性呼吸系统疾病，全球约14%儿童和8%成人受累。当前标准治疗包括吸入性糖皮质激素（inhaled corticosteroids, ICS）和支气管扩张剂，主要缓解急性症状，但不能逆转已形成的慢性气道重塑（airway remodeling），后者为难治性哮喘的病理标志。气道重塑由支气管上皮细胞（bronchial epithelial cell, BEC）损伤和功能障碍驱动，尤其在白细胞介素-4（interleukin-4, IL-4）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）协同刺激下。未控制的气道重塑导致肺功能进行性下降、生活质量受损和死亡率增加。铜死亡（cuproptosis）是新近鉴定的铜依赖调节性细胞死亡，机制不同于凋亡、铁死亡和坏死性凋亡，由铜稳态受损和活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生驱动。已有生物信息学分析发现哮喘患者中铜死亡相关差异表达基因，体内研究显示铜死亡通过促进上皮-间充质转化和气道重塑触发慢性哮喘；但靶向铜死亡治疗哮喘的潜力仍未充分探索。虎杖苷（Polydatin）是从虎杖中分离的天然二苯乙烯苷，口服生物利用度较其苷元白藜芦醇高4–5倍，具有抗炎、抗氧化和免疫调节活性，在肺纤维化和急性肺损伤等呼吸系统疾病中显示治疗效力。在哮喘模型中，虎杖苷通过激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2）通路减轻气道炎症和氧化应激。然而，虎杖苷能否通过调节BEC铜死亡发挥抗哮喘保护作用尚待解决。因此，研究人员以BEAS-2B细胞作为慢性哮喘下BEC损伤体外模型，研究虎杖苷的保护作用及机制，提出其通过NRIP2/NRF2轴恢复铜稳态并抑制铜死亡，从而扩展了虎杖苷已知抗氧化作用之外的机制基础，并提示其作为慢性气道重塑潜在治疗候选物。

关键技术方法：研究人员从GeneCards数据库检索哮喘相关基因和铜死亡相关基因，并用SwissTargetPrediction数据库预测虎杖苷候选靶点。人支气管上皮BEAS-2B细胞购自中国科学院细胞库（上海）。以rhIL-4（20 ng/mL）联合TGF-β（5 ng/mL）处理48 h建立体外BEC损伤模型，并以50 μM虎杖苷同时共处理；用NRIP2 shRNA质粒瞬时敲低NRIP2。检测细胞活力（CCK-8）、细胞内铜含量、细胞内ROS（DCFH-DA）和线粒体ROS（MitoSOX Red）、划痕愈合迁移、NRF2转录因子活性、qRT-PCR和western blot。统计使用GraphPad Prism 9.1，采用t检验、单因素方差分析及Tukey事后检验，n≥3，P<0.05为显著。

研究结果：
3.1 虎杖苷减轻rhIL-4/TGF-β诱导的支气管上皮细胞损伤。通过细胞活力检测发现，rhIL-4/TGF-β时间依赖性降低BEAS-2B细胞活力，48 h抑制最显著；虎杖苷单独处理低于50 μM时无显著细胞毒性；虎杖苷显著减轻rhIL-4/TGF-β诱导的活力下降，但仅50 μM有统计学显著保护作用，20 μM无显著作用。划痕愈合实验显示，rhIL-4/TGF-β增强BEAS-2B迁移，虎杖苷显著逆转该迁移增强。结论：虎杖苷可减轻rhIL-4/TGF-β诱导的体外BEC损伤。

3.2 虎杖苷改善rhIL-4/TGF-β诱导的铜稳态损伤。通过细胞内铜含量测定，对照组、虎杖苷单独组、rhIL-4/TGF-β组和联合组分别为2.28、2.03、4.19和2.20 μmol/g蛋白，虎杖苷逆转了rhIL-4/TGF-β引起的铜升高。qRT-PCR显示，rhIL-4/TGF-β显著下调铜输出蛋白ATP7A和ATP7B mRNA，虎杖苷逆转该下调；SLC31A1和COX17 mRNA无显著变化；ATOX1也被rhIL-4/TGF-β下调，但虎杖苷不能逆转。原文指出，比色铜测定检测总细胞内铜而非直接触发铜死亡的不稳定铜池，因此总铜数据应谨慎解释，不能作为铜死亡诱导铜超载的直接证据。结论：rhIL-4/TGF-β损害BEC铜稳态，虎杖苷主要经增强铜外排改善该损伤。

3.3 虎杖苷抑制rhIL-4/TGF-β诱导的支气管上皮细胞铜死亡。通过DCFH-DA和MitoSOX Red流式检测，DCFH-DA阳性细胞比例在对照组、虎杖苷单独组、rhIL-4/TGF-β组和联合组分别为12.8%、12.9%、24.3%和14.7%；MitoSOX阳性细胞比例分别为2.6%、2.4%、14.1%和9.3%，表明rhIL-4/TGF-β升高细胞内和线粒体ROS，虎杖苷显著降低。Western blot显示，铜死亡标志物FDX1和DLST蛋白被rhIL-4/TGF-β明显下调，虎杖苷显著逆转。原文强调，DCFH-DA检测整体细胞内ROS，MitoSOX Red特异性检测线粒体超氧化物，二者互补。结论：虎杖苷可抑制rhIL-4/TGF-β诱导的BEC铜死亡。

3.4 虎杖苷逆转rhIL-4/TGF-β处理的支气管上皮细胞中NRF2耗竭并与NRIP2信号相关。生物信息学分析将3175个哮喘相关基因、151个铜死亡相关基因与99个虎杖苷预测靶点取交集，得到NRF2和MTF1两个重叠基因，研究人员选择NRF2进一步验证。Western blot显示，虎杖苷增加NRIP2和NRF2蛋白表达，并逆转rhIL-4/TGF-β引起的NRIP2和NRF2耗竭；NRF2转录因子活性实验显示，虎杖苷增强NRF2活性并改善rhIL-4/TGF-β引起的活性受损。NRIP2瞬时敲低后，NRF2表达时间依赖性受抑制，NRF2转录活性显著下降。结论：NRF2可能是NRIP2下游靶点；但原文指出，若无挽救实验证明NRIP2敲低或NRF2抑制时虎杖苷保护失效，NRIP2/NRF2轴仍属相关性发现，不能排除其他通路参与。

讨论总结：哮喘全球约3.39亿人受累。当前ICS、长效β₂-激动剂（long-acting β₂-agonists, LABAs）和生物制剂主要针对急性炎症，不能逆转已建立的气道重塑；约30%患者对皮质类固醇反应差，长期使用有全身不良反应，生物制剂成本高且适用标准窄。慢性哮喘中M2巨噬细胞分泌IL-4、IL-13和TGF-β，协同作用于BEC。铜稳态由铜输入蛋白SLC31A1和铜输出蛋白ATP7A/ATP7B维持；FDX1作为铜死亡核心上游调节因子，DLST是铜依赖脂酰化下游靶点。铜死亡与肺癌、慢性阻塞性肺疾病和脓毒症相关急性肺损伤等有关。本研究中，rhIL-4/TGF-β引起铜超载并伴ATP7A和ATP7B下调，SLC31A1无显著变化，虎杖苷主要增强铜外排。讨论也指出多项限制：FDX1和DLST仅测总蛋白，未检测脂酰化或聚集状态；总铜非不稳定铜池；ATP7A/ATP7B仅测mRNA；50 μM体外浓度与虎杖苷口服绝对生物利用度约2.9%及体内血浆浓度存在差异；NRIP2敲低在基础培养条件下进行，且缺少挽救实验；虎杖苷与IL-4/TGF-β共处理48 h，模拟预防而非治疗；BEAS-2B单层和2D划痕迁移不能支持“逆转气道重塑”；仍需体内验证。天然化合物如protopine、luteolin和linarin在哮喘中显示潜力。既往虎杖苷研究涉及P2X7R-NLRP3、TLR4/P2X7R和NRF2通路，本研究则提供其调节铜死亡的证据。NRF2受KEAP1调控，激活抗氧化反应元件，上调HO-1和NQO1；NRF2也是铜死亡上游调节因子，例如创伤性脑损伤中NRF2缺乏经IRF7上调SLC31A1加重铜死亡，富马酸二甲酯激活NRF2抑制铜死亡，merestinib结合NRF2并上调ATP7A/ATP7B。NRIP2可稳定β-catenin，但其与NRF2的确切分子联系仍需免疫共沉淀和蛋白酶体降解实验。虎杖苷作为多酚可能直接螯合铜离子，类似白藜芦醇，因此其降低铜水平可能部分独立于NRIP2/NRF2；需通过紫外-可见光谱或质谱检测虎杖苷–Cu²⁺复合物、结构类似物比较、铜选择性荧光探针及NRIP2/NRF2抑制下实验区分。ATP7A/ATP7B蛋白水平验证及吸入给药药代动力学–药效学研究也有待开展。

研究结论翻译：总之，本研究表明，虎杖苷可通过NRIP2/NRF2轴恢复铜稳态并抑制铜死亡，从而减轻rhIL-4/TGF-β诱导的支气管上皮细胞损伤。这些发现为慢性哮喘发病机制提供了新见解，并提示虎杖苷是值得进一步研究的潜在治疗候选药物。然而，需要进一步体内研究和机制研究来验证这些发现并转化为临床应用。还应承认，本研究存在局限：虎杖苷与IL-4/TGF-β共同处理48 h，为预防而非治疗干预；所有实验使用BEAS-2B单层体外模型，划痕实验仅测2D迁移；NRIP2/NRF2轴经生物信息学和敲低实验鉴定，但需挽救实验建立因果关系；无挽救实验时该轴仍为相关性，其他通路可能参与。论文作者为Yawen Fu、Binghan Shen、Hongsheng Lin、Xuequn Guo。