《Letters in Drug Design & Discovery》：Integrated network pharmacology and experimental validation reveals that atractylenolide Ⅱ/Ⅲ from Atractylodes macrocephala Koidz. Alleviate LPS-induced trophoblast dysfunction by regulating PTGS2/IL6-mediated tube-like network formation
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背景：早产（preterm birth，PTB）是围产期发病率和死亡率的主要原因，目前有效的干预措施有限。白术（Atractylodes macrocephala Koidz.，AMK）在传统医学中长期以来被用于安胎，但其对与PTB密切相关的炎症介导的滋养层细
背景：早产（preterm birth，PTB）是围产期发病率和死亡率的主要原因，目前有效的干预措施有限。白术（Atractylodes macrocephala Koidz.，AMK）在传统医学中长期以来被用于安胎，但其对与PTB密切相关的炎症介导的滋养层细胞损伤的调控机制尚不清楚。
方法：研究人员从TCMIP、OrganChem和HERB数据库收集AMK的核心活性成分，并通过SwissTargetPrediction和CTD预测靶点。PTB相关靶点从GeneCards和GEO数据集GSE174415获取。对重叠靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）、GO和KEGG富集分析，并与管状网络形成基因集取交集，候选靶点进一步通过三种机器学习算法筛选。通过分子对接和简正模式分析（normal mode analysis，NMA）预测白术内酯Ⅱ/Ⅲ（atractylenolide Ⅱ/Ⅲ，Atr Ⅱ/Ⅲ）与PTGS2/IL6的结合亲和力。采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的HTR-8/SVneo细胞模型，通过CCK-8、Western blot、成管实验和EdU实验评估细胞活力、管状网络形成相关的滋养层功能、增殖及靶点表达。
结果：共鉴定出4个关键成分、379个药物靶点和1642个疾病靶点，其中74个为重叠基因。富集分析突出显示了涉及炎症和管状网络形成相关滋养层功能的通路。机器学习鉴定出JAK2、PTGS2、EGFR、NOS3、FLT1和IL6为核心靶点，其中PTGS2和IL6在GSE174415中表达上调。分子对接预测Atr Ⅱ与PTGS2以及Atr Ⅲ与IL6之间存在有利的结合相互作用。体外实验中，15 μM的Atr Ⅱ/Ⅲ未显示明显细胞毒性。Atr Ⅱ抑制LPS诱导的PTGS2过表达，Atr Ⅲ抑制LPS诱导的IL6过表达；两种化合物均升高VEGF-A和ANG-2水平，并促进增殖和管状网络形成。
结论：AMK来源的Atr Ⅱ和Atr Ⅲ通过抑制PTGS2和IL6，恢复炎症条件下受损的管状网络形成，从而缓解LPS诱导的滋养层细胞功能障碍。本研究阐明了AMK对炎症相关胎盘损伤的细胞水平保护机制，并为其在缓解PTB相关胎盘功能障碍中的潜在应用提供了初步的细胞学证据。
论文解读
一、研究背景与问题
早产（preterm birth，PTB）指妊娠满28周但不足37周的分娩，是围产期新生儿发病和死亡的首要原因，全球约10%的妊娠发生早产。早产儿不仅面临呼吸窘迫综合征、颅内出血等急性并发症，还面临神经发育障碍和代谢综合征等远期健康问题。尽管围产期医学取得显著进展，早产发生率并未明显下降，现有的预防和治疗策略如孕激素、宫缩抑制剂和糖皮质激素疗效有限且常伴随明显不良反应。因此，寻找安全有效的新型预防策略并阐明其分子机制具有重要临床意义。
炎症反应失调和管状网络形成受损被认为是自发性早产（spontaneous preterm birth，SPTB）的关键驱动因素。宫内感染或炎症应激可激活胎盘和蜕膜细胞，诱导多种促炎细胞因子释放，破坏母胎界面稳态，最终触发早产。同时，滋养层细胞充分的管状网络形成对胎盘发育和功能至关重要。
白术（Atractylodes macrocephala Koidz.，AMK）是菊科植物白术的干燥根茎，在中医中被长期用作安胎要药，常用于胎动不安和先兆流产等妊娠相关疾病。现代植物化学研究鉴定其主要活性成分为白术内酯Ⅰ（Atr Ⅰ）、白术内酯Ⅱ（Atr Ⅱ）、白术内酯Ⅲ（Atr Ⅲ）和白术酮。其中Atr Ⅱ和Atr Ⅲ是中国药典中AMK质量控制的主要标志物，也是近年药理学研究最深入的活性成分，具有明确的抗炎、免疫调节和胃黏膜保护活性。Atr Ⅱ（C15H20O2）为桉叶烷型倍半萜内酯，Atr Ⅲ（C15H20O3）是其对应的8β-羟基衍生物，C-8β含氧差异赋予两者不同的理化性质和靶点结合特征。然而，AMK预防早产的确切分子机制，特别是其是否通过调控胎盘滋养层细胞管状网络形成相关靶点发挥作用，尚不清楚。本研究因此聚焦Atr Ⅱ和Atr Ⅲ作为代表性活性成分开展机制研究。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员整合网络药理学、机器学习、分子对接和体外实验，系统探究AMK活性成分缓解与PTB发病相关的炎症性滋养层功能障碍的分子机制。关键技术方法包括：从TCMIP、OrganChem和HERB数据库筛选AMK活性成分，经SwissTargetPrediction和CTD预测靶点；从GeneCards和GEO数据集GSE174415（包含32例非裔美国女性胎盘组织RNA-seq数据，16例SPTB和16例足月产）获取PTB相关靶点；利用STRING数据库构建PPI网络，采用CytoHubba的MCC算法识别核心节点；通过clusterProfiler进行GO和KEGG富集分析；与GeneCards管状网络形成相关基因集取交集后，采用LASSO回归、SVM-RFE和随机森林三种机器学习算法交叉筛选候选靶点；利用AutoDock Vina进行分子对接，iMODS服务器进行简正模式分析；在LPS诱导的HTR-8/SVneo人胎盘滋养层细胞模型中，通过CCK-8、Western blot、成管实验和EdU实验验证功能。PTGS2和IL6的表达进一步在独立GEO数据集GSE18809（白种人胎盘组织，早产5例，足月5例）中验证。
三、研究结果
1. AMK与PTB重叠靶点的鉴定
研究人员通过GSE174415数据集的差异表达分析生成火山图和热图，鉴定出与SPTB相关的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。Venn图分析显示AMK活性成分靶点与PTB疾病靶点之间存在74个共享基因，并构建了成分-靶点-疾病网络，体现了AMK多成分、多靶点的调控特征。
2. 核心重叠靶点的功能富集分析
KEGG富集分析显示核心靶点显著富集于PI3K-Akt信号通路、凋亡、TNF信号通路、JAK-STAT信号通路、VEGF信号通路和MAPK信号通路，这些通路均与PTB背景下的炎症反应、管状网络形成和胎盘发育密切相关。GO分析显示生物学过程主要涉及细胞群体增殖的正向调控、氧化应激反应、基因表达正向调控和糖皮质激素应答；细胞组分主要定位于细胞质、胞质溶胶、细胞表面和核周区域；分子功能主要涉及相同蛋白结合和蛋白激酶结合。
3. 机器学习筛选管状网络形成相关核心靶点
74个药物-SPTB重叠靶点与53个管状网络形成相关基因取交集获得10个候选基因。LASSO回归、SVM-RFE和随机森林三种算法交叉筛选后获得6个重叠核心基因：JAK2、PTGS2、EGFR、NOS3、FLT1和IL6。其中PTGS2和IL6在SPTB胎盘中显著上调，与PTB的病理特征一致，而EGFR、FLT1、JAK2和NOS3的差异表达不显著或趋势与研究假设不符。基于差异表达显著性、与PTB炎症和管状形成病理的关联强度以及分子对接可行性三项客观标准，研究人员优先选择PTGS2和IL6进行后续体外验证。在独立数据集GSE18809中，PTGS2和IL6在早产胎盘中均显著上调，验证了结果的跨队列一致性。
4. 分子对接与简正模式分析
分子对接结果显示PTGS2与Atr Ⅱ的结合亲和力为?8.3 kcal/mol，关键氢键涉及ALA-327、LEU-352和VAL-369；IL6与Atr Ⅲ的结合亲和力为?6.8 kcal/mol，关键氢键涉及PHE-105、SER-107和LYS-46。简正模式分析的变形性图谱、B因子分析和协方差图揭示了蛋白质-配体复合物的动态柔性和结合口袋内残基的协同运动。
5. Atr Ⅱ和Atr Ⅲ对HTR-8/SVneo细胞功能的影响
CCK-8实验显示0、5、10和15 μM的Atr Ⅱ或Atr Ⅲ无显著细胞毒性，20 μM显示轻微毒性，故选择15 μM作为后续实验浓度。Western blot显示Atr Ⅱ或Atr Ⅲ单独处理可升高VEGF-A和ANG-2蛋白水平，LPS刺激显著降低其表达，Atr Ⅱ或Atr Ⅲ预处理可有效逆转LPS介导的下调。成管实验显示Atr Ⅱ或Atr Ⅲ单独处理增强管状网络形成和总分支长度，LPS严重抑制网络结构形成，Atr Ⅱ或Atr Ⅲ预处理显著恢复细胞成管能力。EdU实验显示Atr Ⅱ或Atr Ⅲ处理提高EdU阳性增殖细胞比例，LPS显著抑制增殖，Atr Ⅱ或Atr Ⅲ预处理显著缓解该抑制效应。Atr Ⅱ单独处理显著下调PTGS2基础蛋白表达，并有效减弱LPS诱导的PTGS2过表达；Atr Ⅲ单独处理显著下调IL6基础蛋白表达，并有效减弱LPS诱导的IL6过表达。
6. 拯救实验验证PTGS2和IL6的关键介导作用
siRNA敲低PTGS2或IL6可增强LPS处理细胞的管状网络形成和增殖，模拟Atr Ⅱ或Atr Ⅲ的保护效应。过表达PTGS2或IL6分别消除Atr Ⅱ或Atr Ⅲ促进成管和增殖的作用。交叉拯救实验显示，在Atr Ⅱ处理细胞中过表达IL6或在Atr Ⅲ处理细胞中过表达PTGS2均不能逆转成管和增殖效应，表明Atr Ⅱ特异性地通过PTGS2发挥作用，Atr Ⅲ特异性地通过IL6发挥作用。
四、讨论与结论
讨论部分指出，IL6是感染诱导早产发病中的关键促炎细胞因子，在SPTB女性的宫颈液、羊水和阴道分泌物中持续检测到升高，并通过旁分泌方式上调PTGS2促进前列腺素合成，增强子宫收缩力和启动分娩。PTGS2是前列腺素合成的限速酶，其上调直接导致子宫收缩介质如前列腺素E2（PGE2）的过量产生。本研究还发现PTGS2和IL6富集于管状网络形成相关基因集，提示这些分子在胎盘血管重塑中也发挥关键调控作用。研究仅对Atr Ⅱ-PTGS2和Atr Ⅲ-IL6复合物进行了分子对接模拟，未进行交叉对接，因此Atr Ⅱ与PTGS2、Atr Ⅲ与IL6的优先配对仅代表基于结合能和文献支持候选相互作用，而非排他性的一对一特异性结合，两种化合物可能通过部分重叠的靶点网络协同改善滋养层炎症和成管能力损伤。富集分析提示PI3K-Akt和JAK-STAT等通路可能参与介导保护效应，但未进行直接的生化验证。机器学习分析作为探索性特征筛选程序，三种算法的交集仅作为候选基因池，核心结论依赖于体外功能实验。研究局限性包括：依赖公共数据库和体外细胞模型，需在动物模型和临床样本中进一步验证；Atr Ⅰ和白术酮的生物学作用及与Atr Ⅱ/Ⅲ的协同作用尚未充分表征；未直接定量细胞内Atr Ⅱ和Atr Ⅲ浓度；简正模式分析为简谐近似方法，无法捕捉非简谐构象变化和溶剂介导的相互作用，需长时程分子动力学模拟；缺乏Atr Ⅱ/Ⅲ与PTGS2/IL6直接物理结合的生化和酶学证据；未检测上清液中PGE2和分泌型IL6水平；GSE174415数据解读受孕龄发育效应、缺乏个体临床元数据、潜在亚临床感染和非裔美国人单一队列等混杂因素限制。
结论：本研究系统揭示了Atr Ⅱ和Atr Ⅲ保护滋养层细胞免受LPS介导炎症损伤的分子网络。机制上，两种化合物分别抑制PTGS2和IL6蛋白丰度，恢复受损的滋养层管状网络形成和增殖能力，并缓解过度炎症激活。本研究为白术的传统安胎应用提供了细胞水平的机制证据，并鉴定了针对PTB相关滋养层功能障碍的候选新分子靶点。由于仅使用体外HTR-8/SVneo细胞模型，未采用评估实际早产或妊娠结局的动物模型，当前发现不能直接确认其对临床PTB的治疗效果，需进一步开展体内和临床研究以支持转化应用。
