M2极化巨噬细胞来源的外泌体miR-3662通过抑制IRF8/RASSF5信号通路并增强自噬促进肺腺癌细胞的顺铂耐药性

《Lung Cancer》：Exosomal miR-3662 originating from M2-polarized macrophages facilitates cisplatin resistance of lung adenocarcinoma cells through inhibiting the IRF8/RASSF5 cascade and boosting autophagy

　　

摘要 顺铂（DDP）耐药性仍然是肺腺癌（LUAD）治疗中的一大障碍。本研究探讨了M2巨噬细胞来源的外泌体miR-3662是否促进DDP耐药性，并揭示了其潜在机制。miR-3662在LUAD组织中表达上调，在DDP耐药样本和细胞系中进一步升高，并与不良预后相关。功能上，过表达miR-3662增强了DDP耐受性、集落形成能力、增殖和自噬相关活性，同时抑制了细胞凋亡；抑制miR-3662则逆转了这些效应。M2巨噬细胞外泌体将miR-3662转移到LUAD细胞中并促进耐药性，而GW4869处理或去除外泌体中的miR-3662则减弱了这种保护作用。机制上，miR-3662直接结合IRF8的3′UTR并降低IRF8蛋白表达。IRF8占据RASSF5启动子并激活其转录。因此，miR-3662介导的IRF8/RASSF5轴下调诱导了细胞保护性自噬。恢复IRF8或RASSF5可对抗M2外泌体诱导的自噬并使细胞对DDP重新敏感。在异种移植模型中，靶向外泌体miR-3662恢复了IRF8/RASSF5信号，减少了自噬标志物，抑制了肿瘤生长，并提高了DDP疗效。这些发现确定了一条新型微环境来源的囊泡通路，即M2巨噬细胞外泌体miR-3662通过抑制IRF8/RASSF5和激活自噬驱动DDP耐药性，为克服LUAD铂类耐药提供了新的潜在治疗策略见解。

引言 肺癌在全球范围内仍是导致癌症相关死亡最多的恶性肿瘤，肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌（NSCLC）的主要组织学类型[1-4]。分子分类改善了患者分层，靶向药物和免疫检查点抑制剂重塑了NSCLC治疗[5-8]。尽管如此，许多患者缺乏可操作突变，在初始有效治疗后复发，或在一线、围手术期或联合治疗中仍需要使用细胞毒性化疗[6-8]。顺铂（DDP）仍然具有重要临床意义，因为它能诱导DNA交联、复制应激、细胞周期阻滞和凋亡[9-13]。然而，原发性和获得性耐药限制了DDP在LUAD中的获益持续时间。

耐药表型由多个协同过程产生，包括药物摄取或外排改变、解毒、高效DNA修复、凋亡逃避、上皮可塑性、代谢重编程和适应性应激信号[9-13]。尽管肿瘤细胞内在改变是必需的，恶性细胞还从周围的肿瘤微环境（TME）中获得保护。这与肿瘤演化依赖于癌细胞、免疫细胞、基质成分、血管、细胞外基质和可溶性介质之间持续相互作用的标志模型一致[14,15]。因此，定义允许LUAD细胞耐受DDP的TME来源线索对于理解治疗逃逸至关重要。

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是TME的主要组成部分，调节炎症、免疫抑制、血管生成、侵袭和治疗反应[16-19]。尽管肿瘤中巨噬细胞表型超出了严格的M1/M2二元分类，但该框架在体外建模促炎和组织重塑状态时仍然实用[20,21]。M2样巨噬细胞经常促进肿瘤进展，并可通过分泌因子和细胞外囊泡损害治疗[18,19,22]。外泌体是小的脂双层囊泡，能够在细胞间传递蛋白质、脂质、mRNA和非编码RNA[23-25]。由于细胞外囊泡制剂具有异质性，MISEV指南建议评估形态、尺寸分布、阳性标志物和阴性细胞标志物[26]。囊泡介导的通讯有助于癌症中的转移、免疫重塑和治疗耐药[24,27-29]。在肺癌中，外泌体miRNA已被证实参与DDP耐药和NSCLC进展，但控制LUAD DDP敏感性的具体巨噬细胞来源miRNA程序仍未完全表征[30-32]。

miRNA通过与靶转录本配对并抑制翻译和/或促进mRNA不稳定来调节基因表达[33,34]。异常miRNA网络影响癌症起始、进展、免疫逃逸和药物反应[35-38]。先前的研究突出了miR-3662在各种恶性肿瘤中的多方面作用，它经常作为肿瘤增殖和代谢重编程的关键调节因子，具体取决于细胞背景。在胰腺导管腺癌（PDAC）中，miR-3662表达下调；其恢复通过靶向HIF-1α和损害有氧糖酵解逆转吉西他滨耐药[39]。在肝细胞癌（HCC）中，miR-3662通过靶向HK2抑制生长和侵袭，其下调与增强的糖酵解相关[40]。在乳腺癌（尤其是TNBC）中，miR-3662高表达并通过Wnt/β-catenin促进肿瘤生长/转移[41]；在胃癌中，它通过靶向CAB39L并调节AMPK/糖酵解促进增殖/侵袭[42]。此外，血浆/血清外泌体中的miR-3662作为肺腺癌和乳腺癌早期检测的非侵入性生物标志物[43]。然而，控制LUAD DDP敏感性的具体巨噬细胞来源miRNA程序，特别是涉及miR-3662的，仍未完全表征。自噬是一种溶酶体依赖性回收途径，帮助细胞应对营养短缺、细胞器损伤和治疗应激[44-48]。在化疗期间，自噬可能使癌细胞能够回收受损成分并存活于基因毒性损伤中，尽管其作用高度依赖于背景，应结合自噬流进行解释[45,48-53]。

干扰素调节因子8（IRF8）是一种转录因子，与髓样分化、免疫调节和肿瘤抑制程序相关[54-59]。RASSF5/NORE1A是Ras关联结构域家族成员，据报道在凋亡、衰老、Hippo/MST信号和肿瘤抑制中发挥作用[60-67]。在本研究中，我们检验了M2巨噬细胞来源的外泌体miR-3662是否通过抑制IRF8、减少IRF8依赖性RASSF5转录和增强自噬来驱动LUAD DDP耐药性。我们整合了公共数据集、临床样本、体外功能测定、机制拯救实验和异种移植模型来定义该调节通路。

生物信息学分析 LUAD的表达谱和临床病理信息从癌症基因组图谱肺腺癌队列（TCGA-LUAD；https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）检索，并使用基于公共数据库的工具进行分析。使用UALCAN（https://ualcan.path.uab.edu/index.html）比较了正常肺组织和原发性LUAD组织之间以及临床病理亚组之间的miR-3662丰度，包括肿瘤分期、吸烟史、淋巴结转移和...

miR-3662表达升高与LUAD中DDP耐药和不良预后相关 我们首先使用公共数据集和患者样本评估了miR-3662在LUAD中的临床相关性。TCGA-LUAD分析显示原发性LUAD组织中hsa-miR-3662表达高于正常肺组织（图1A）。当按临床病理特征分层样本时，我们观察到miR-3662在各种肿瘤分期、吸烟状态组、淋巴结转移类别和组织学亚型中维持升高水平（图1B–E）。miR-3662并非局限于...

讨论 本研究阐明了一种囊泡介导的机制，即M2巨噬细胞促进LUAD中的DDP耐药。M2巨噬细胞外泌体将miR-3662带入LUAD细胞。一旦转移，miR-3662降低了IRF8蛋白丰度，削弱了IRF8驱动的RASSF5转录，并诱导了与自噬相关的生存状态。该模型得到了患者数据、基于细胞的扰动测定、靶标验证、启动子分析、拯救实验和异种移植测试的支持。这些发现将...

结论 总之，M2巨噬细胞来源的外泌体miR-3662通过抑制IRF8蛋白表达、减少RASSF5转录和诱导细胞保护性自噬促进LUAD对DDP的耐药。干扰外泌体介导的miR-3662转移或恢复IRF8/RASSF5信号在体外和异种移植中减弱了耐药性。这种微环境驱动的通路可能为未来生物标志物开发和改善铂类反应性的策略提供信息，尽管需要在患者来源的...中进行验证。

CRediT作者贡献声明 余凤强：概念化、形式分析、调查、方法学、验证、撰写初稿。肖家州：数据整理、调查、方法学、验证、可视化、撰写初稿、撰写——审阅与编辑。林南龙：撰写初稿、可视化、验证、软件、资源、调查、概念化。林建波：可视化、验证、软件、资源、方法学、数据整理、概念化。张梦龙：...

伦理声明 所有参与者或其法定代理人均已签署书面知情同意书，同意参与本研究并发表文章。已尊重参与者的隐私权。

本研究包含器官或组织供体。本研究包含人类生物材料，并已获供体或其近亲属或法定代理人同意用于本研究及发表文章。本研究使用的样本并非来源于处死的人类研究...

本研究按照研究开展地点的相关法律、法规框架和指南进行。本研究已获福建医科大学第一附属医院机构伦理委员会批准（批准号：[2015]084-2(2022-2025)）。

知情同意 所有患者均签署书面知情同意书，同意将其组织标本和临床数据用于本研究并发表汇总结果。本稿件不包含任何个人可识别信息、图像或视频，因此无需进一步的个人同意。

伦理批准与参与同意 本研究按照《赫尔辛基宣言》和ARRIVE动物研究指南进行，并获福建医科大学第一附属医院伦理委员会批准（临床伦理编号：No. [2015]084–2(2022–2025)；动物伦理批准编号：IACUCFJMU 2024-Y-1692）。所有患者在样本采集和临床数据审阅前均已签署书面知情同意书。

资金来源 本研究得到福建省科技创新联合基金支持（编号：2024Y9206）。

利益冲突声明 作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢 不适用。

余凤强 | 肖家州 | 林南龙 | 林建波 | 张梦龙 | 陈思哲 | 赖发财 福建医科大学第一附属医院胸外科，福建省福州市台江区茶中路20号，350005，中国