基于核酸选择性杂交的亲和色谱法：与体积排阻色谱的在线联用分析

《Journal of Separation Science》：Affinity Chromatography With Selective Nucleic Acid Hybridization: Direct Coupling With Size Exclusion Chromatography

摘要 通过柱上杂交，固定化寡核苷酸的亲和液相色谱（affinity liquid chromatography，aLC）对核酸靶标具有高选择性。本研究描述了一种填充3.5 μm无孔聚苯乙烯/二乙烯基苯吸附剂并经链霉亲和素共价修饰的2.1 mm × 20 mm原型亲和柱的制备与评价。通过生物素-链霉亲和素键在柱上固定生物素化寡核苷酸，制备了两种不同的亲和柱：（i）生物素化25核苷酸寡脱氧胸苷（dT25）柱，以及（ii）生物素化21核苷酸TP53寡核苷酸柱。dT25柱用于聚腺苷酸化信使RNA（messenger RNA，mRNA）及腺苷寡核苷酸变体的分析。TP53柱应用于单核苷酸多态性分析。核酸结合在0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中进行；保留组分以水或10%乙腈水溶液洗脱。研究证明，dT25柱可选择性地保留带poly(A)尾的EPO、EGFP和Cas9 mRNA，而无尾mRNA不被保留。dT25柱可分离dA14–dA25寡腺苷酸长度变体以及含胞苷取代的dA25变体。TP53柱可将完全互补的21核苷酸序列与单核苷酸错配序列基线分离。将dT25柱与250 ?、1.7 μm体积排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）柱直接串联，可在RNase T1消化完整mRNA后实现改进的poly(A)尾长度测定；mRNA回收率超过98%，清洗后残留率低于0.1%。

亲和色谱与核酸选择性杂交：基于固定化寡核苷酸的核酸分析平台

1. 研究背景与问题提出

亲和色谱（affinity liquid chromatography，aLC）是一种基于特异性分子识别的高选择性液相色谱分离技术，自20世纪60年代末发展以来，已成为生物大分子纯化、分离、表征和分析的重要工具。与反相液相色谱（reversed-phase LC，RP LC）依赖分析物疏水性进行非特异性保留不同，aLC通过固定化配体与分析物之间的特异性亲和相互作用实现强保留，例如抗原-抗体相互作用或核酸-核酸间的序列特异性杂交。常见的亲和配体包括单克隆抗体、蛋白A/G/L、肽、适配体、纳米抗体和凝集素等。然而，这些生物聚合物配体在苛刻洗脱条件下可能发生不可逆变性而丧失活性，限制了柱寿命和应用范围。

固定化寡核苷酸的亲和色谱利用核酸杂交原理实现选择性分离，通常采用15–25核苷酸（nt）长度的固定化寡核苷酸作为配体，通过柱上杂交选择性捕获目标核酸。尽管此类方法具有高选择性，但亲和配体制备成本高、耗时长，亲和色谱介质价格昂贵，且苛刻的固定化或洗脱条件可能使配体失活。此外，非特异性吸附也可能影响选择性。基于上述背景，本研究旨在探索以固定化寡核苷酸为配体的aLC柱对核酸靶标的保留与分离能力，并评估其在mRNA分析、序列变体鉴别及基因分型中的应用潜力。

2. 研究内容与主要结论

研究人员制备了两种原型亲和色谱柱：dT25柱（固定化25 nt生物素化寡脱氧胸苷，固定量14 nmol）和TP53柱（固定化21 nt生物素化TP53寡核苷酸，固定量13 nmol），柱规格均为2.1 mm × 20 mm，填充3.5 μm无孔聚苯乙烯/二乙烯基苯链霉亲和素修饰颗粒。研究结果表明，dT25柱在0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中可选择性保留带poly(A)尾的EPO、EGFP和Cas9 mRNA，而无尾mRNA不被保留；该柱还可分离dA14–dA25寡腺苷酸长度变体及含胞苷取代的dA25变体。TP53柱则可将完全互补的21 nt序列与单核苷酸错配序列基线分离，为aLC在基因分型中的应用提供了概念验证。此外，将dT25柱与SEC柱串联，建立了dT25/SEC联用方法，可在RNase T1消化mRNA后对poly(A)尾进行高效富集和准确长度测定，mRNA回收率超过98%，清洗后残留率低于0.1%。

3. 主要技术方法

本研究采用的关键技术方法包括：（1）基于链霉亲和素-生物素相互作用的柱上配体固定化技术，通过多次进样生物素化寡核苷酸直至饱和，并以生物素溶液封闭剩余链霉亲和素活性位点；（2）亲和液相色谱（aLC）方法，采用0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）或0.1 M醋酸铵（pH 6.8）作为杂交结合缓冲液，以水或10%乙腈水溶液进行洗脱；（3）RNase T1酶解mRNA释放poly(A)尾；（4）dT25亲和柱与体积排阻色谱（SEC）柱的串联联用方法，采用等度条件（0.1 M磷酸钠缓冲液，pH 7.4），通过25 μL注射洗脱方式释放保留组分。mRNA样本包括TriLink BioTechnologies的EPO、EGFP、Fluc和Cas9 mRNA，以及NIST的Fluc mRNA标准品和Kactus Bio的无尾mRNA。

4. 研究结果

4.1 dT25柱在mRNA分析中的应用

研究人员将2.5 μg mRNA样品注入dT25柱，采用0.1 M磷酸钠缓冲液结合、水梯度洗脱。结果显示，无尾KH20 mRNA在0.1 min处以尖锐突破峰流出，不被保留；而带poly(A)尾的EGFP和Cas9 mRNA在约2.1 min处被洗脱。购买的纯化mRNA样品中存在少量无尾组分（EGFP中占0.5%，Cas9中占7.3%），且该比例不随上样量变化，表明并非柱过载所致。收集峰组分分析证实，未保留峰确实不含poly(A)尾。

4.2 dT25柱对腺苷寡核苷酸的保留与选择性

研究人员考察了dA10–dA25寡脱氧腺苷在dT25柱上的保留行为，采用0.1 M磷酸钠缓冲液结合、10%乙腈线性梯度洗脱、35°C柱温。结果表明，短于dA10的寡核苷酸在柱空隙体积处流出，而约14–25 nt长度的dAn可获得有效保留。在0.4 mL/min流速下可部分分离dA16–dA22混合物，将流速降至0.1 mL/min并相应延长梯度时间后，分离度显著提高，表明A-T双链在柱上的杂交/熔解为相对缓慢的过程。此外，EPO mRNA的poly(A)尾若预先与dT150寡核苷酸在溶液中杂交，则丧失在dT25柱上的保留能力，提示PCR等产生双链产物的应用需先转化为单链才能进行aLC杂交。

4.3 亲和色谱柱对序列变体的鉴别

研究人员将25 nt寡聚(A)序列中1–3个腺苷替换为胞苷，考察dT25柱对序列变体的分辨能力。结果显示，单核苷酸变体（包括位于3'或5'端的变体）均可被分辨；位于序列中心或含多个修饰的变体对A-T双链稳定性破坏更严重，保留显著降低。进一步制备TP53柱，以21 nt完全互补序列（21G WT）与三个中心单核苷酸错配变体（21T、21A、21C）进行分离实验。结果表明，三个错配变体保留较弱，与野生型序列实现基线分离，为aLC基因分型提供了概念验证，并有望用于NGS前的稀有变体富集。

4.4 dT25/SEC串联方法用于mRNA高级分析

针对单独SEC分析RNase T1消化后mRNA的局限性——长mRNA消化产生大量短寡核苷酸干扰信号、不完全消化片段干扰poly(A)尾峰、分段式poly(A)尾（如NIST Fluc mRNA中30 nt + 70 nt间隔10 nt接头）易被其他消化产物掩盖——研究人员建立了dT25/SEC串联方法。该方法以0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）为等度流动相，mRNA消化物注入后，未保留的Fraction 1通过dT25柱进入SEC柱分离；保留的Fraction 2（poly(A)尾）随后通过25 μL 10%乙腈注射洗脱释放，以尖锐峰进入SEC柱分析。使用rA30–rA120标准品建立校准曲线，测得EPO、EGFP、Fluc和Cas9 mRNA的poly(A)尾长度为123–124 nt，与文献报道一致。对NIST Fluc mRNA的分析中，SEC与dT25/SEC方法均测得两个poly(A)片段长度为76.3和36.6 nt，但后者背景显著更干净、结果更可靠。残留实验表明，首次25 μL注射洗脱的mRNA回收率超过98%，后续注射残留逐渐降低，第五次注射后信号降至0.1%以下。为消除残留，研究人员在每次分析后采用五次25 μL洗脱液注射加12 min等度清洗的清理程序。

5. 讨论与结论

本研究建立的dT25亲和柱在常用缓冲液体系中可有效保留寡腺苷酸和poly(A)尾mRNA，具有良好峰形、高回收率和低残留。该柱对poly(A)尾具有高选择性，可排除无尾mRNA。寡聚(A)序列长度大于10 nt即可通过杂交保留并按长度分离，含1–3个胞苷取代的25 nt变体也可与母体序列分离。TP53柱可区分完全互补序列与中心单核苷酸错配变体，证明aLC可基于杂交强度区分野生型与含SNP的核酸序列，适用于DNA基因分型。将dT25柱与SEC柱串联，通过选择性富集poly(A)尾并去除干扰性无尾消化产物，显著提高了poly(A)尾长度测定的分析特异性。综上，亲和色谱被确立为一种用于核酸选择性捕获、富集和鉴别的高通用性平台，在mRNA分析和序列特异性核酸表征方面具有广阔应用前景。