负载野生型EMSCs外泌体的SF/PCL2:5/PVA同轴纳米纤维膜经PI3K/Akt/ERK1/2信号通路挽救p75NTR?/?介导的成骨缺陷

《Materials Today Bio》：EMSCs-derived exosomes rescue p75NTR?/? -mediated osteogenesis deficiency via PI3K/Akt/ERK1/2 signaling pathways

　　

关键尺寸骨缺损的修复仍是骨科外科医生面临的重大挑战，尤其当成骨作用因p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor, p75^NTR)缺陷而受损时。然而，其潜在分子机制尚未完全明确。本研究旨在阐明p75^NTR在骨再生中的作用，并通过将野生型外胚层间充质干细胞外泌体(wild-type ectomesenchymal stem cells exosomes, WT-Exo)纳入丝素蛋白/聚己内酯_2:5/聚乙烯醇(silk fibroin/polycaprolactone_2:5/polyvinyl alcohol, SF/PCL_2:5/PVA)同轴纳米纤维膜进行控释，开发一种无细胞策略以挽救p75^NTR?/?缺陷介导的成骨缺陷。p75^NTR?/?小鼠表现出骨量降低和骨化延迟，而负载WT-Exo的膜部分恢复了p75^NTR?/?细胞的成骨缺陷，并增强了碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、I型胶原(collagen type I, Col-I)、骨桥蛋白(osteopontin, OPN)和Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2, Runx2)等成骨标志物的表达，同时激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)/细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)信号通路。将负载WT-Exo的膜植入p75^NTR?/?小鼠关键尺寸颅骨缺损后，通过WT-Exo的持续释放，缺损部位的新骨形成显著改善。总体而言，本研究结果强调了p75^NTR在外胚层间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells, EMSCs)成骨分化中的关键作用，并证明通过同轴静电纺丝膜递送的WT-Exo是一种有效的无细胞干预方法，可逆转p75^NTR缺陷引起的骨形成缺陷，为基因缺陷相关骨疾病提供了一种有前景的策略。

研究背景：关键尺寸骨缺损超出骨内在再生能力，不能自发愈合，是骨科和颅颌面外科难题。成功修复不仅需结构重建，还需恢复细胞和分子机制。p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor, p75^NTR)是肿瘤坏死因子受体超家族成员，参与细胞死亡、存活和分化，并日益被认为参与骨骼稳态和再生。然而，p75^NTR在成骨中的作用存在争议：部分研究显示其促进间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)成骨和颅面骨再生，另一些研究显示沉默p75^NTR增强成骨和血管生成。因此，p75^NTR在外胚层间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells, EMSCs)成骨中的精确作用尚不完全清楚。MSC来源外泌体低免疫原性且无永久基因修饰，但直接注射受快速清除、缺损部位驻留不足和持续生物利用度差限制。为此，研究人员将WT-EMSCs来源外泌体(WT-Exo)纳入丝素蛋白/聚己内酯_2:5/聚乙烯醇(silk fibroin/polycaprolactone_2:5/polyvinyl alcohol, SF/PCL_2:5/PVA)同轴静电纺丝膜控释系统，以明确p75^NTR作用并开发无细胞干预。作者为 Jiaqi Ye、Xiehui Jin、Yanda Huang、Pau Lam Khup、Yaoteng Yu、Mengying Cheng、Qing Yuan、Dongdong Xu、Xin Nie、Gu Cheng。该论文发表于《Materials Today Bio》。

关键技术方法：使用来自Jackson Laboratory的p75^NTR?/?小鼠（经靶向删除p75^NTR基因外显子III生成）；从E16.5d胚胎颌面组织分离EMSCs，并行基因型、流式和成骨/成脂/成软骨分化鉴定；差速超速离心分离WT-Exo和p75^NTR?/?-Exo，经NTA、TEM、WB和DiI摄取鉴定；同轴静电纺丝制备SF/PCL/PVA膜并筛选SF/PCL=2:5与WT-Exo 10 mg/mL；采用CCK-8、活/死染色、ALP/ARS、免疫荧光、WB、RNA-seq及PI3K激活剂740Y-P、抑制剂LY294002、ERK抑制剂PD98059；在8周龄p75^NTR?/?小鼠建立3 mm颅骨临界缺损，行micro-CT、生物力学、HE、免疫组化和器官HE。

3.1 p75^NTR敲除小鼠骨发育能力受损：PCR基因型确认；p75^NTR?/?小鼠体型较小，股骨和下颌骨骨体积分数(bone volume fraction, BV/TV)、骨密度(bone mineral density, BMD)、骨小梁数目(trabecular number, Tb.N)降低；Alizarin Red/Alcian Blue双染显示骨化延迟、软骨增多而骨减少，提示p75^NTR缺陷伴骨量降低和骨小梁结构受损。

3.2 EMSCs多向分化：流式显示WT和p75^NTR?/? EMSCs均表达CD29、CD90、Sca-1而少表达CD45；诱导染色显示p75^NTR?/? EMSCs钙沉积、脂滴和软骨结节减少，提示敲除损害多向分化能力。

3.3 WT-Exo表征：NTA、TEM和WB确认WT-Exo与p75^NTR?/?-Exo具外泌体特征，DiI标记显示被EMSCs内化；WT-Exo浓度依赖促进p75^NTR?/? EMSCs增殖，50 μg/mL作用最强并部分恢复增殖。

3.4 WT-Exo挽救p75^NTR?/? EMSCs受损成骨能力：WB、ALP/ARS染色和免疫荧光显示WT-Exo增加Col-I(collagen type I, I型胶原)、ALP(alkaline phosphatase, 碱性磷酸酶)、OCN(osteocalcin, 骨钙素)、Runx2(runt-related transcription factor 2, Runt相关转录因子2)和OPN(osteopontin, 骨桥蛋白)，而p75^NTR?/?-Exo抑制WT-EMSCs成骨标志物，提示WT-Exo可挽救成骨缺陷。

3.5 (SF/PCL_2:5/PVA)^WT-Exo膜表征：SEM、荧光、FTIR和XRD显示核壳结构，SF/PCL=2:5直径最均一，WT-Exo封装于核心且未显著改变膜化学和晶相。

3.6 外泌体体外释放：BCA显示28天三相释放，10 mg/mL在释放效率和可控性间平衡，释放的WT-Exo可被p75^NTR?/? EMSCs摄取。

3.7 膜生物相容性：CCK-8和活/死染色显示(SF/PCL_2:5/PVA)^WT-Exo与空白膜细胞相容性良好，负载WT-Exo促增殖。

3.8 膜挽救p75^NTR?/? EMSCs成骨缺陷：ALP、ARS和Col-I/OPN免疫荧光显示(SF/PCL_2:5/PVA)^WT-Exo组早期分化和晚期矿化最强，持续递送优于游离WT-Exo。

3.9 RNA-Seq分析：WT-Exo组186个基因上调、90个下调；KEGG富集PI3K/Akt通路，GO富集骨发育、骨化和成骨细胞分化；Venn鉴定Igf1、Fgf2、Vegfa、Itgav、Itgb3、Epha2、Atf4上调而Il6下调，提示协调PI3K/Akt/ERK1/2。

3.10 PI3K/Akt和ERK1/2协调激活：WB和药理干预显示(SF/PCL_2:5/PVA)^WT-Exo增加p-Akt和p-ERK1/2，740Y-P增强、LY294002降低，PD98059抑制ERK1/2但不影响Akt；p-Akt/p-ERK1/2共定位增强，ALP/ARS相应变化，支持整合信号轴。

3.11 体内微结构和生物力学评估：在p75^NTR?/?颅骨缺损中，micro-CT显示膜组骨表面积(bone surface area, BS)、BV/TV、BMD改善且8周最明显，最大载荷(Fmax)接近WT并优于游离WT-Exo和空白膜。

3.12 体内组织学评估：HE显示膜组连续桥接、骨小梁厚密，Col-I和OPN免疫组化表达更高；主要器官HE正常，提示系统生物相容性良好。

3.13 WT-Exo体内激活PI3K/Akt和ERK1/2：免疫组化显示膜组p-Akt、p-ERK1/2及下游ATF4(activating transcription factor 4, 激活转录因子4)、Runx2表达增加，与体外机制一致。

讨论部分认为，p75^NTR作用具背景依赖性，但本实验条件支持其正性促骨作用；同轴静电纺丝可提高外泌体驻留和持续释放，优化条件为SF/PCL=2:5和10 mg/mL WT-Exo。研究局限包括BCA仅测总蛋白，不能区分完整与降解外泌体，需NTA和标志物分析；PI3K/Akt到ERK1/2的分子联系尚需遗传验证；还需大动物和长期安全性研究。结论翻译：研究人员的研究证明，p75^NTR是成骨分化和骨再生的关键调节因子，p75^NTR缺陷与骨形成受损和再生能力降低相关。WT-Exo有效恢复p75^NTR缺陷EMSCs的成骨功能并增强骨修复，伴随PI3K/Akt/ERK1/2信号轴激活增加。此外，将WT-Exo纳入同轴SF/PCL_2:5/PVA纳米纤维膜提供持续局部外泌体递送并显著改善体内颅骨缺损愈合。总体而言，这些发现支持一种整合的无细胞策略，将外泌体介导的信号调节与缓释生物材料平台结合，为开发支架辅助外泌体疗法治疗挑战性颅颌面骨缺损提供依据。