一种经过验证的方法，用于培养混合神经胶质细胞系，可培养出具有反应性的小胶质细胞

《Methods》：A validated method for banking mixed glial cultures that yield responsive microglia

　　

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统中的常驻免疫细胞，在维持大脑稳态中发挥着关键作用。原代细胞培养系统对于研究小胶质细胞的生物学特性至关重要，它允许在开展资源密集型的体内（in vivo）研究之前，直接评估转基因模型中的基因功能。然而，传统的混合神经胶质细胞培养衍生的原代小胶质细胞（pMG）系统受到收获时间的严格限制，并且可扩展性较差。为了克服这些障碍，我们开发并验证了首个能够实现混合神经胶质细胞长期冷冻保存并分离出活性强、反应灵敏的小胶质细胞的方案。从先前冷冻的混合神经胶质细胞中分离出的小胶质细胞与从新鲜培养物中获得的小胶质细胞相比，存在一些基线差异，包括形态上的轻微变化。尽管存在这些表型差异，但从冷冻培养物中分离出的小胶质细胞对环境刺激的反应与从新鲜培养物中分离出的小胶质细胞相似。当暴露于代谢（高葡萄糖）和炎症（脂多糖LPS、β-淀粉样蛋白）刺激时，冷冻培养物中的小胶质细胞表现出的形态变化、吞噬作用和炎症反应与从新鲜培养物中分离出的pMG相当。这些发现表明，冷冻混合神经胶质细胞可以保留其对环境信号作出适当反应的能力。总之，这项工作确立了从冷冻的小鼠混合神经胶质细胞中生成小胶质细胞的第一个经过验证的方法，为传统方法提供了一种可扩展且时间上更为灵活的替代方案。

引言

小胶质细胞作为大脑中的巨噬细胞，在维护大脑健康和疾病中起着至关重要的作用[1] [2]。小胶质细胞通过快速响应环境变化和有害刺激来调节大脑的免疫系统。在静态状态下，它们具有高度的运动性，并在整个大脑中巡逻以寻找碎片或炎症信号[1]。当遇到外部刺激时，小胶质细胞会迅速被激活。小胶质细胞的激活已被确定为衰老[3]、压力[4]以及阿尔茨海默病[5]和帕金森病[6]等神经退行性疾病中的关键过程。虽然小胶质细胞的激活表现出多种表型，但通常其特征是形态改变[7]、吞噬作用增强[8]以及促炎细胞因子的释放[4]。然而，随着对小胶质细胞异质性认识的加深，小胶质细胞状态的变化也与代谢变化有关[5]。激活的小胶质细胞的代谢变化类似于瓦尔堡效应，即代谢从氧化磷酸化转向糖酵解[9] [10]。此外，疾病状态下小胶质细胞的代谢重编程还涉及脂质处理紊乱和脂滴（LDs）的积累[11] [12] [13]。由于这些代谢适应，小胶质细胞会经历特定环境下的形态变化。尽管不同形态状态下的小胶质细胞的功能后果尚不清楚，但普遍认为激活的小胶质细胞在从静态状态转变为疾病相关状态时会改变其大小和形状[7] [14]。例如，在慢性应力模型中，小胶质细胞表现出高度分化的复杂表型[15]，而在神经退行性疾病和衰老模型中则表现出杆状或变形虫样的表型[16] [17] [18]。此外，小胶质细胞在性别上的差异也会影响其形态和功能，这为将形态与功能相对应增添了另一层复杂性[16] [19]。因此，研究驱动小胶质细胞代谢和形态变化的细胞、分子和遗传因素的工具非常有必要，不仅有助于定义疾病机制，还有助于探索恢复小胶质细胞功能并改善疾病结局的新干预方法。

虽然体内（in vivo）模型有助于在生理学背景下观察小胶质细胞的变化，但体外（in vitro）平台对于研究那些在体内难以检测的细胞机制至关重要。有许多体外系统可用于研究小胶质细胞的激活和代谢状态的变化（例如，iPSC衍生的小胶质细胞、永生化的小胶质细胞和原代小胶质细胞（pMG））。然而，每种方法都有其优势和局限性。例如，尽管iPSC衍生的小胶质细胞能够反映年龄或疾病相关的状态[20]，但它们的维护成本较高，并且存在影响重复性的遗传变异[21]。相比之下，永生化细胞系（如HMC3和BV-2）提供了成本更低、更均匀的研究小胶质细胞的平台。然而，永生化小胶质细胞不能准确反映体内小胶质细胞的状态，并且据报道其对外部刺激的反应不如pMG强烈[22]。尽管iPSC衍生的和永生化的的小胶质细胞各有优势，但在使用转基因小鼠研究特定基因如何调节小胶质细胞功能以预防或促进疾病时，pMG仍然具有更高的价值。从这些复杂模型中提取小胶质细胞并实证确定细胞和分子机制的能力对于扩展我们对疾病过程的理解至关重要。尽管认识到pMG可能不如iPSC衍生的小胶质细胞那样准确地反映疾病相关过程，但它们使我们能够利用强大的遗传模型更好地反映体内的细胞状态，并提供了更具经济可行性的选择[22] [23]。

虽然体内模型有助于观察生理条件下的小胶质细胞变化，但体外平台对于研究那些在体内难以检测的细胞机制是必不可少的。有许多体外系统可用于研究小胶质细胞的激活和代谢状态的变化（例如，iPSC衍生的小胶质细胞、永生化的小胶质细胞和原代小胶质细胞（pMG））。然而，每种方法都有其自身的优势和局限性。例如，尽管iPSC衍生的小胶质细胞能够反映年龄或疾病相关的状态[20]，但它们的维护成本较高且存在遗传变异，这可能会影响其重复性[21]。相比之下，永生化细胞系（如HMC3和BV-2）提供了成本更低且更均匀的研究小胶质细胞的平台。然而，永生化小胶质细胞不能准确反映体内小胶质细胞的状态，并且据报道其对外部刺激的反应不如pMG强烈[22]。尽管iPSC衍生的和永生化的小胶质细胞各有优势，但在使用转基因小鼠研究特定基因如何调节小胶质细胞功能以预防或促进疾病时，pMG仍然具有更高的价值。从这些复杂模型中提取小胶质细胞并实证确定细胞和分子机制的能力对于扩展我们对疾病过程的理解至关重要。尽管知道pMG可能不如iPSC衍生的小胶质细胞那样准确地反映疾病相关过程，但它们使我们能够利用强大的遗传模型更好地反映体内细胞状态，并提供更具经济可行性的选择[22] [23]。

虽然可以使用FACS或MAG分选技术分离原代小胶质细胞[24]，但长时间的分选过程可能会破坏小胶质细胞的激活状态，进而影响其代谢[25]。因此，从混合神经胶质细胞中“摇匀”分离方法是获得相对纯净、未受干扰的小胶质细胞群体的最有效方式，以便用于后续实验。这些方法已经使用了几十年，并在之前有详细描述[23] [26]。简而言之，从混合神经胶质细胞培养物中分离小胶质细胞包括将整个大脑的单细胞悬液接种到培养皿中，然后摇晃培养皿以将松散附着的小胶质细胞从混合神经胶质细胞的顶层分离出来。然而，这种方法受到可用小鼠时间和细胞制备可扩展性的限制。尽管先前的研究表明小胶质细胞可以在不影响其功能的情况下被冷冻[27] [28]，但目前还没有明确的方案或功能评估方法适用于从冷冻的整个大脑混合神经胶质细胞培养物中分离出的pMG。同样，从同一混合神经胶质细胞培养物中多次“摇匀”可能会在实验之间引入变异性，但摇晃次数对小胶质细胞功能的影响尚未正式报道。对于研究小胶质细胞和神经疾病的研究人员来说，深入了解小胶质细胞摇匀方案至关重要，因为这些方法可以精确控制培养时间，便于样本储存，并实现可扩展的实验，同时保持小胶质细胞的整体功能和代谢完整性。

为了满足科学界的需求，我们在这里描述了首个用于冷冻混合神经胶质细胞培养物的方案，以实现未来小胶质细胞分离的储存。此外，我们还检验了从第一次或第二次摇匀中分离出的pMG在新鲜（FS）和冷冻（FZ）条件下对各种环境刺激的反应是否存在相似的形态和代谢变化。尽管冷冻会导致小胶质细胞形态上的可测量差异，但从冷冻培养物中分离出的小胶质细胞对高葡萄糖（High Glu）、脂多糖（LPS）和寡聚β-淀粉样蛋白（Aβo）等环境刺激的反应与从新鲜培养物中分离出的小胶质细胞相似。因此，虽然FZ原代小胶质细胞能够再现功能反应，但在实验中强烈建议始终使用相同摇晃次数的FS或FZ细胞。总体而言，我们的研究首次报道了冷冻和解冻混合神经胶质细胞的方案，以便随后生成可用于多种下游应用的反应灵敏的pMG。

章节片段

从p0-p2小鼠幼崽中分离混合神经胶质细胞培养物

本研究所有实验均使用C57BL/6J小鼠进行，实验方案（参考编号#0115和#0815）已获得科罗拉多大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，确保符合《实验室动物护理和使用指南》、《动物福利法》和PHS政策的建议。小鼠每笼不超过5只，饲养在约20°C的环境中，实行14-10小时的明暗循环，并可以自由接触标准

冷冻的小鼠混合神经胶质细胞培养物可以解冻并摇匀以分离pMG

先前的文献表明，原代混合神经胶质细胞培养物可以冷冻保存以供将来使用[27] [28]，但并未详细描述冷冻-解冻方案，也未比较冷冻后小胶质细胞的機能。尽管如此，这些资源成为优化和验证本研究中描述的混合神经胶质细胞冷冻-解冻方案的起点。

简而言之，我们分离出生后0-2天（p0-p2）小鼠幼崽的大脑，将其合并并与其消化液一起孵育

讨论

冷冻混合神经胶质细胞培养物的能力提供了以前无法实现的对pMG细胞的控制。在本文中，我们展示了可以从先前冷冻的原代混合神经胶质细胞培养物中产生反应灵敏的小胶质细胞，而不会丧失细胞活性。我们通过对FS和FZ培养物中的s1和s2 pMG进行高葡萄糖（High Glu）或脂多糖（LPS）处理来验证这一点。在高葡萄糖处理下，我们未发现pMG的形态或大小在摇晃和FS-FZ状态之间发生变化（图3）。在LPS处理下，我们

研究局限性

尽管从冷冻培养物中产生反应灵敏的小胶质细胞是体外方法学领域的一项重大进展，但本文也有一定的局限性。我们通过细胞形态、吞噬作用和细胞因子释放等指标来评估小胶质细胞的激活状态，但这些指标只能大致反映小胶质细胞对外部刺激的反应。然而，可以添加其他指标来更细致地量化小胶质细胞功能的改变（例如，脂滴（LD）的积累、Seahorse代谢测定）。

资金来源

本研究得到了NIH-NIA R21AG091650的支持，以及授予KDB的NIH-NIA R01、授予AMS的T3263032819和授予JEH的T32DK120521的支持。

撰写过程中关于生成式人工智能和人工智能辅助技术的声明

在准备本文档的过程中，作者使用了Perplexity和Copilot工具来校对部分内容的清晰度。使用这些工具后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文所述工作的利益冲突或个人关系。

致谢

我们感谢Wendy Macklin博士及其实验室的成员与我们共享他们的摇匀器。同时，我们也感谢科罗拉多大学安舒茨医学园区内分泌学、糖尿病和代谢科以及先进光显微镜核心设施对我们BioSpa Cytation 5成像仪和3I Marianas旋转盘共聚焦显微镜的持续财务支持。最后，我们感谢科罗拉多大学安舒茨分校人类免疫监测共享资源中心的Jodi Livesay

Anna M. Sturno|James E. Hassell|Katelyn M. Baker|Garrett J. Potter|Emily Artman|Christy S. Niemeyer|Kimberley D. Bruce

科罗拉多大学安舒茨医学园区内科内分泌学、代谢和糖尿病科，美国科罗拉多州奥罗拉市