《Molecular & Cellular Proteomics》：Two-Dimensional Size-Exclusion Chromatography-Based Isolation and Characterization of Plasma-Derived Extracellular Vesicle Subpopulations from Prostate Cancer Patients
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细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是一类由细胞和组织释放的纳米级囊泡及颗粒（凝集体），存在于血液及其他生理体液中，其生物分子货物可调控关键的分子与细胞通路，因此在临床诊断应用和基础生物学研究中具有重要价值。然而，从复杂生物基质
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是一类由细胞和组织释放的纳米级囊泡及颗粒（凝集体），存在于血液及其他生理体液中，其生物分子货物可调控关键的分子与细胞通路，因此在临床诊断应用和基础生物学研究中具有重要价值。然而，从复杂生物基质中分离高度异质性的EVs，并进一步将其分选为不同亚群，目前仍面临巨大挑战。本研究开发了一种新型、简便的二维尺寸排阻色谱（two-dimensional size-exclusion chromatography, 2D-SEC）方法，用于血浆来源EVs的分离与分群，以替代现有低纯度的EV分离方法。该技术能够富集EV亚群富集组分，同时进一步去除高丰度血浆污染物，从而改善低丰度EV相关蛋白的检测。此外，研究人员从前列腺癌（prostate cancer, PCa）患者和健康供者中分离出血浆来源的EV亚群富集组分，并采用基于质谱的定量蛋白质组学分析，评估PCa相关及肿瘤相关蛋白的存在情况。结果表明，与一维SEC（1D-SEC）相比，2D-SEC获得的EV分离物实现了更深的蛋白质组学图谱分析，鉴定出参与PAM、MAPK和NF-κB通路的蛋白质，提示所开发的2D-SEC方法有望推动微创临床应用及更广泛的EV生物学研究。
**论文解读：二维尺寸排阻色谱分离血浆细胞外囊泡亚群及其在前列腺癌液体活检中的潜力**
**研究背景与问题**
前列腺癌（PCa）是全球男性第二大常见癌症，2022年新发病例约140万，占男性癌症新发病例的约14%。传统PCa诊断主要依赖前列腺特异性抗原（PSA）检测，但PSA升高也可见于良性前列腺增生和前列腺炎等非癌性疾病，导致过度诊断和不必要的侵入性活检。因此，学界呼吁开发基于多种蛋白或基因组合的下一代PCa检测方法，以提高特异性并辅助早期诊断。另一方面，细胞外囊泡（EVs）作为循环生物标志物的天然载体，近年来受到广泛关注。EVs携带蛋白质、核酸等生物分子，可反映来源细胞和组织的病理状态。然而，血浆是高度复杂的生物基质，其中高丰度游离蛋白（如白蛋白、免疫球蛋白）和脂蛋白颗粒（如高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL）在浓度上远超EVs，严重干扰低丰度EV相关蛋白的检测。经典的超速离心（UC）法虽为金标准，但存在耗时、低通量、易导致EV聚集等缺陷；一维尺寸排阻色谱（1D-SEC）虽较温和，但对脂蛋白的去除不充分，且无法有效分选EV亚群。为此，研究人员开发了基于三种不同色谱介质的二维尺寸排阻色谱（2D-SEC）方法，旨在提高EV纯化效率、实现EV亚群分群，并探索其在PCa液体活检中的应用价值。
**研究内容与结论**
研究人员利用Sepharose CL-2B作为第一维SEC介质，从血浆中初步富集EVs；随后将浓缩的EV分离物加载至由Sephacryl 500和Sephacryl 1000组成的双层柱（第二维SEC），依据粒径大小将EVs进一步分群为2D-Early、2D-Middle和2D-Late三个亚群富集组分。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）、Western blot和基于质谱的定量蛋白质组学（nanoLC-DIA-MS）等技术，对1D-SEC和2D-SEC分离物进行了全面表征。结果显示，2D-SEC显著降低了脂蛋白污染，平均粒径从1D-SEC的约71 nm增加至2D-SEC各亚群的190–233 nm，且粒径随洗脱顺序递减，表明实现了基于尺寸的EV分群。蛋白质组学分析发现，2D-SEC鉴定了112个1D-SEC未检出的蛋白质，其中多个为EV相关蛋白（如ADAM10、LAMP1、syntenin 1、TSAP6），并显著降低了载脂蛋白A-I和B-100的丰度。将该方法应用于10例健康对照和10例PCa供者血浆后，主成分分析显示健康组与PCa组明确分离；值得注意的是，前列腺酸性磷酸酶（PAP）仅在2D-SEC的PCa样本中检出，而1D-SEC未检出。此外，2D-SEC使PAM、MAPK和NF-κB通路相关蛋白的鉴定数量分别增加47%、44%和57%，并鉴定出多个与PCa不良生存相关的差异表达蛋白（如YWHAQ、FEN1、SLC25A5、HNRNPA2B1）。该研究证实2D-SEC是一种可行的EV亚群分离新策略，能够加深血浆EV蛋白质组覆盖深度，为微创液体活检诊断PCa提供了新工具。
**主要技术方法**
研究使用的主要方法包括：利用三种尺寸排阻色谱树脂（Sepharose CL-2B、Sephacryl 500、Sephacryl 1000）构建二维SEC系统；采用NTA检测颗粒浓度与粒径；TEM观察EV形态；Western blot验证EV标志物（CD9、β-catenin）和血浆污染标志物（载脂蛋白B100、白蛋白、IgG）；以及基于数据非依赖采集的纳米液相色谱串联质谱（nanoLC-DIA-MS）进行无标记定量蛋白质组学分析。样本来自自述健康男性的混合血小板去除血浆（用于方法开发），以及商业购买的年龄匹配的10例健康对照和10例PCa患者血浆（经14000 × g离心去除残余血小板）。蛋白质组学数据已上传至ProteomeXchange（PXD063252）。
**研究结果**
1. **Sephacryl固定相的评估：** 扫描电镜显示Sephacryl 500和1000微球形态完整、表面孔隙尺寸分别约为50–100 nm和500–1000 nm，支持其用于EV分群的物理特性。
2. **一维与二维分离后完整EV表征：** NTA显示1D-SEC的颗粒峰出现在第6–9组分，而2D-SEC的颗粒峰宽且出现在第10–22组分；将2D-SEC的10–13、14–17、18–21组分分别合并为2D-Early、2D-Middle、2D-Late，三个组分平均粒径依次为233 ± 38 nm、212 ± 17 nm和190 ± 19 nm，均大于1D-SEC的71 ± 1 nm。TEM确认各组分中均存在典型杯状EV形态，且2D-SEC组分中较小颗粒（<20 nm）明显减少。
3. **蛋白表征：** SDS-PAGE和Western blot显示，2D-SEC显著降低了载脂蛋白B100、白蛋白和IgG在EV组分中的丰度，同时保留了EV标志物CD9和β-catenin；2D-Middle组分因处于色谱峰顶点而呈现最高的蛋白信号。
4. **蛋白质组学分析：** 无监督层次聚类显示1D-SEC与2D-SEC蛋白谱显著不同；EV相关蛋白（如14-3-3 zeta/delta）在1D-SEC和2D-SEC中丰度变化不大，但ADAM10、LAMP1、syntenin 1、TSAP6仅在2D-SEC中检出。载脂蛋白AI在2D-SEC各组分中较1D-SEC降低约24–62倍，载脂蛋白B100降低约6–30倍，证实2D-SEC有效去除了HDL和LDL污染。112个2D-SEC特有蛋白的基因本体论（GO）分析显示其细胞定位主要为外泌体相关区域，生物学功能涉及信号转导、细胞通讯和细胞生长等。
5. **PCa与对照血浆EV比较：** 健康对照和PCa供者1D-SEC分离物的TEM与NTA结果在粒径和浓度上无显著差异。蛋白质组学聚类显示健康对照与PCa样本各自聚成一类；PCA显示两组的95%置信区间明显分离（1D-SEC中无重叠，2D-SEC各亚群中基本分离）。PAP仅在2D-Early和2D-Late组分的PCa样本中检出。
6. **上调通路分析：** 与1D-SEC相比，2D-SEC在PCa样本中检出的PAM、MAPK和NF-κB通路相关蛋白数量分别增加47%、44%和57%；凋亡相关蛋白增加233%（从6个增至20个），雄激素介导信号相关蛋白从3个增至6个。差异表达蛋白（DEPs）分析鉴定出多个仅在2D-SEC中富集且与PCa不良预后相关的蛋白，包括YWHAQ、SLC25A5、FEN1和HNRNPA2B1，其中FEN1和HNRNPA2B1的过表达与患者生存率显著相关（p < 0.05，基于TCGA PRAD数据库的Kaplan-Meier分析）。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，2D-SEC通过双层柱（Sephacryl 1000+500）延长了有效分离范围（40–100,000 kDa），使粒径小于400 nm的EV亚群能够进入Sephacryl 1000的孔网络进行初步分群，再经Sephacryl 500层将HDL（~8 nm）和LDL（~22–28 nm）与大多数EV（>30 nm）进一步分离。虽然2D-SEC导致颗粒回收率下降至约0.02–0.03%，但这是脂蛋白被有效去除和EV亚群富集的必然结果。对于一些高丰度游离蛋白（如白蛋白），2D-SEC的额外去除效果有限，可能归因于EV蛋白冠的形成，这与现有文献一致。通过将2D组分重新混合（Remix）实验，证实载脂蛋白的显著降低确实来自第二维色谱柱的作用，而非样品处理损失。研究结论强调，这种2D-SEC方法可扩展、通量较高，能有效去除脂蛋白并富集EV亚群，为剖析EV货物蛋白及其在疾病（尤其是PCa）中的作用提供了新工具；未来需在大规模独立队列中验证其作为PCa液体活检标志物发现平台的可行性。
