nanoLC-Zeno TOF 7600质谱平台用于细胞类型分辨空间蛋白质组学的系统评价

《Molecular & Cellular Proteomics》：Evaluation of the nano Liquid Chromatography coupled with Zeno TOF 7600 Mass Spectrometer for Cell Type-Resolved Spatial Proteomics

在这项研究中，研究人员系统评价了nanoLC-Zeno TOF平台，采用数据非依赖采集（data-independent acquisition，DIA）模式，从1至200 ng标准K562酶解产物中鉴定出3,142至7,059个蛋白质群（protein groups）。此外，一种靶向采集策略通过Zeno激活检测到184条信号增强的肽段。为实现细胞类型分辨的空间蛋白质组学（spatial proteomics），研究人员开发了一套整合图像引导激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）的工作流程，用于胃癌组织分析。在30分钟nanoLC梯度下，从代表癌细胞、癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）和免疫细胞的0.2 mm²区域中定量了2,514种蛋白质，这些区域由多重免疫组织化学（multiplex immunohistochemistry，mIHC）界定。该空间蛋白质组学方法揭示了临床胃癌样本肿瘤微环境中的细胞异质性；靶向验证进一步在癌细胞富集区与CAF富集区之间鉴定出由103条肽段组成的12种癌症相关蛋白的差异表达。该工作流程为临床组织样本的空间蛋白质组学分析提供了一种实用策略。

空间蛋白质组学（spatial proteomics）能够揭示组织样本中蛋白质组的空间异质性，尤其在复杂肿瘤微环境中，细胞类型分辨的蛋白质特征对理解疾病机制至关重要。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合多重免疫组织化学（mIHC）和激光捕获显微切割（LCM）已实现若干空间细胞类型分辨分析，如Deep Visual Proteomics和SCPro等工作流程。Zeno TOF 7600质谱仪配备Zeno trap技术，可顺序释放离子以提升离子利用率和灵敏度。已有研究使用分析流（>200 μL/min）和微流（~5 μL/min）LC联用Zeno SWATH，但尚未系统评价其与纳升流（~300 nL/min）LC联用的性能，而纳升LC仍是高灵敏蛋白质组学分析的主流。此外，新的DIA采集模式ZT scan（扫描SWATH）尚待测试。因此，研究人员系统评价了nanoLC-Zeno TOF 7600平台在非靶向DIA和靶向MRMHR中的表现，并结合本团队先前报道的SCPro工作流程，建立并验证了一套细胞类型分辨空间蛋白质组学方法，应用于临床胃癌FFPE组织样本。

研究人员使用标准K562酶解产物、HeLa/酵母/大肠杆菌混合物、合成肽段混合物以及临床胃癌组织样本，评估了Zeno SWATH、ZT Scan和MRMHR模式。结果显示，Zeno On模式显著提高鉴定深度与定量准确性；ZT Scan在低样本量下进一步提高鉴定数和重现性；靶向MRMHR可对复杂背景中宽动态范围的多肽进行准确定量。基于图像引导LCM，研究人员从胃癌FFPE组织中成功收集了癌细胞、CAFs和免疫细胞三类细胞区域（每类0.2 mm²，三个生物重复），定量了2,514个蛋白质群，并通过差异表达分析和功能富集揭示了肿瘤微环境的细胞异质性。靶向验证确认了12种癌症相关蛋白在癌细胞富集区与CAF富集区之间的差异表达。该工作流程为临床组织空间蛋白质组学提供了实用策略。

主要关键技术方法：临床样本为FFPE胃癌组织切片（伦理批准号SYL-202124-02），另包括标准K562、HeLa、酵母、大肠杆菌培养样本。采用nanoLC（M-Class II UPLC，75 μm内径色谱柱，300 nL/min）耦合Zeno TOF 7600质谱仪，使用Zeno SWATH、ZT Scan DIA和MRMHR靶向模式；空间流程包括mIHC四色染色（PanCK、αSMA、CD45、DAPI）、StrataQuest随机森林分类器图像分割、VistaNavi生成切割路径、MMI CellCut LCM采集，SISPROT/iPAC制备；数据处理使用DIA-NN、Spectronaut和Skyline，统计分析使用R。

结果1：Zeno SWATH与ZT Scan的DIA性能。研究人员比较Zeno开/关模式，发现Zeno On使匹配的b/y碎片离子数提高约8.8倍，蛋白质群鉴定增加36.9%，肽段增加64.4%；在20-200 ng范围内趋势一致。定量准确性方面，200 ng HeLa/酵母（1:10和1:5）混合物中，酵母蛋白群被准确定量（1,967和2,329），同时总蛋白群达9,518；三种物种（人/酵母/大肠杆菌）六种比例样本的定量比值与预期一致。低样本量下，10分钟短梯度优于长梯度，1 ng K562鉴定1,820个蛋白质群，5 ng鉴定3,989个；2.5 ng鉴定2,999个，优于文献中微流LC结果。ZT Scan在50 ng K562中鉴定7,141个蛋白质群和61,026条肽段，CV<10%蛋白质比例提高45.7%；7.5 Th窗口优于10 Th，1 ng输入下鉴定3,142个蛋白质群。

结果2：MRMHR靶向蛋白质组学评价。使用11条iRT肽评估MRMHR，Zeno On使信号增强>5倍。31肽混合物（11条iRT+20条PepCalMix）在100 ng HEK 293T消化物中系列稀释，多数肽段定量比值接近预期2倍变化，但低浓度样本存在基质干扰。184条合成肽（0.01-10 ng）掺入100 ng酵母消化物，三个稀释度下检测率93%（161/184），平均每峰数据点超过10，超过70%的肽段CV<20%，组间相对定量中位比值与预期一致。

结果3：在Zeno TOF 7600上实施空间蛋白质组学。H&E和mIHC染色与未染色切片相比，蛋白质/肽段鉴定数相当（200 ng时3,705和4,331个蛋白质群；500 ng时17,567和22,691条肽段）。0.2 mm²组织优化梯度，30分钟梯度鉴定2,859个蛋白质群，较60分钟仅损失约10%肽段，通量提高一倍。不同SWATH窗口（38/65/85）对鉴定影响很小。ZT Scan在0.2 mm²样本中与Zeno SWATH蛋白质群数相近（2,722 vs 2,707），但肽段CV更稳定。肿瘤富集区与基质富集区蛋白质谱显著不同，同一区域0.1与0.3 mm²样本高度相关。

结果4：图像引导的细胞类型分辨分割与切割。四色mIHC标记DAPI、PanCK、αSMA、CD45，分别显示细胞核、癌细胞、CAF和免疫细胞。StrataQuest随机森林分类器生成癌细胞掩膜，经直方图门控筛选出45个肿瘤阳性区域，VistaNavi生成切割路径，LCM成功获取三类细胞，每类0.2 mm²，三个重复。

结果5：临床胃癌患者的细胞类型分辨空间蛋白质组学。从三类细胞中定量2,514个蛋白质群。癌细胞中KRT8高表达，TGFB1在CAFs中高表达。PCA显示三类细胞明显分离。差异表达分析显示，癌细胞相对于CAFs和免疫细胞上调的蛋白质包括KRT8、KRT18、KRT19、S100P、ANXA4、GOLM1、ACSL6、ASS1、SLC25A1等；下调蛋白质包括LRRC45、COL8A1、PLCB2、ELN等。免疫细胞与CAFs间513个差异蛋白质，免疫细胞上调含CD74、HLA I/II类蛋白质等。热图聚类显示5个蛋白质簇，分别富集于肌动蛋白细胞骨架组织、细胞外基质（ECM）组织、MHC蛋白复合物组装、代谢等通路，说明三类细胞具有独特功能特征。

结果6：区域特异性靶向蛋白质组学评估。选择与KRT8高度相关的蛋白质簇（12个蛋白质，117条肽段）作为靶标，在癌细胞富集区（38.1%癌细胞）和CAF富集区（1.3%癌细胞）进行MRMHR分析，检出103/117条肽段（88%）。KRT8所有14条肽段在癌细胞富集区高表达；ASS1（4.3倍）、KRT18（2.3倍）、TXRD1（3.0倍）、ANXA4（2.1倍）、ALDH2（2.2倍）等显著富集于癌细胞富集区。

讨论与结论：该平台集成了nano-LC与Zeno TOF，在低输入（<10 ng）下具有显著优势；ZT Scan提高重现性；75 μm内径色谱柱在灵敏度与稳健性间取得平衡；系统支持从发现到验证的同一工作流，且成本效益高，易于推广。FFPE兼容性使其适用于回顾性临床研究。不足：低浓度靶向分析存在基质效应；较小采样面积导致输入量低；短梯度会降低肽段产量。未来Zeno TOF 8600预计进一步提升灵敏度。总之，nano-LC耦合Zeno TOF 7600工作流为空间蛋白质组学提供了变革性工具，能够对有限临床样本进行高分辨分析，并为细胞异质性和肿瘤微环境提供关键见解。展望未来，新推出的Zeno TOF 8600系统据制造商数据有望将MS/MS灵敏度提升至原来的10倍，预计将推动高灵敏、高通量蛋白质组学达到新水平。