糖尿病相关的人角膜缘重塑单细胞图谱

《The Ocular Surface》：A Single-Cell Atlas of Diabetes-Associated Remodeling in the Human Corneal Limbus

单细胞图谱描绘糖尿病相关的人类角膜缘龛变化；糖尿病与基质、黏附和炎症通路改变相关；蛋白质评估揭示与糖尿病相关的关键角膜基因表达变化；研究结果揭示了糖尿病如何损害角膜修复与稳态

**引言**

导致视力障碍的糖尿病（DM）是卫生系统面临的重大挑战。2022年，全球估计有8.28亿人患有糖尿病[1]。糖尿病影响眼部所有部位，其中糖尿病视网膜病变（DR）是最严重的眼部并发症[2]。然而，角膜也常受糖尿病影响，45-70%的糖尿病患者可观察到各种改变[3]。糖尿病的角膜表现包括上皮缺损和脆弱、复发性上皮糜烂、感觉降低、溃疡、水肿、伤口修复异常以及角膜缘上皮干细胞（LESC）功能障碍，统称糖尿病性角膜炎，此外还有基底神经异常，表现为角膜感觉逐渐丧失，即糖尿病性神经病变[4]。

角膜缘位于角膜-巩膜交界处，包含一个特殊的微环境，其中栖息着LESC。这些干细胞通过不断产生向心性迁移以补充角膜上皮的过渡扩增细胞（TAC），在整个生命周期中维持角膜上皮稳态和再生。角膜缘龛由异质性的上皮、基质、血管、免疫和神经细胞群体组成，它们的协调相互作用调控干细胞的静息、活化和分化[5]。此龛的破坏或LESC的功能障碍会损害角膜上皮更新，并导致角膜缘干细胞缺乏和伤口愈合缺陷等病理状态[6]。新兴证据表明，糖尿病改变角膜缘干细胞功能和龛调控，导致上皮修复受损[7, 8]。慢性高血糖通过晚期糖基化终末产物（AGEs）积累、氧化应激和慢性低度炎症使角膜-角膜缘组织暴露于持续代谢应激[4, 8]。这些糖尿病相关改变破坏细胞外基质（ECM），改变细胞-细胞和细胞-基质信号传导，并损害LESC与支持性龛细胞间的通讯[4, 7, 8]。由于角膜缘龛的完整性依赖于上皮、基质、免疫、血管和神经成分之间的协调相互作用，此微环境的破坏会影响LESC的维持和再生功能[5, 6]。在糖尿病中，LESC异常以及角膜上皮再生和伤口愈合受损已被记录，被认为是糖尿病性角膜炎的特征[7, 8]。尽管越来越多的证据支持这些致病机制，但糖尿病相关角膜缘龛功能障碍的细胞群体和分子通路仍不完全清楚。

近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）已成为一种强大的工具，能够进行全面的细胞图谱绘制，基于单细胞转录组分析获得重大发现[9, 10, 11]。该方法可评估细胞异质性，识别稀有或新型细胞亚群，并促进细胞轨迹分析，以揭示发育、干细胞分化、伤口愈合以及疾病与健康状态下单细胞分辨率的动态细胞转变[12, 13, 14, 15, 16]。在过去十年中，scRNA-seq对包括眼表领域在内的许多研究领域产生了深远影响[11, 12, 17, 18, 19, 20, 21, 22]。它促进了多种组织的细胞图谱绘制，揭示了发育和干细胞分化中的机制。在小鼠角膜中，scRNA-seq揭示了两种LESC群体，一种维持角膜上皮稳态和更新，另一种参与伤口愈合和与结膜的边界形成[18]。它还帮助发现了几个新的假性LESC标志物[18, 19, 20, 21, 22]。这些研究展示了角膜缘LESC栖息区的复杂性，以及在角膜伤口愈合和疾病中检查各种细胞群体的重要性。尽管有这些进展，与糖尿病等全身性疾病相关的角膜缘上皮群体转录组改变仍知之甚少，尤其是在单细胞分辨率下。几项单细胞转录组研究已经生成了正常人类和小鼠角膜和角膜缘的详细细胞图谱，鉴定了主要的上皮、基质、免疫、血管和神经细胞群体以及候选LESC标志物[12, 17, 18, 19, 20, 21]。然而，这些研究聚焦于健康组织或发育生物学，并未探讨糖尿病如何改变人类角膜-角膜缘龛的细胞组成、转录程序、细胞间通讯和ECM重塑。因此，对糖尿病相关多种角膜缘细胞群体变化的全面单细胞表征一直缺乏。

因此，我们检查了非糖尿病（N）与糖尿病（DM）人类角膜-角膜缘供体组织中异质性角膜-角膜缘细胞群体内全局基因表达改变、其细胞多样性和它们在复杂角膜缘龛内的相互作用。为弥补现有知识空白，我们首次对DM和N供体的人类角膜-角膜缘组织进行了scRNA-seq检测，全面界定糖尿病相关细胞组成和转录在角膜缘龛不同细胞群体中的变化。我们的分析揭示，特别是在LESC/VEC和角膜缘祖细胞（LPC）簇中，差异表达基因（DEGs）富集于ECM组织、细胞黏附、炎症信号传导和组织重塑相关通路，表明DM相关龛重塑和再生稳态受损。免疫荧光评估显示DM相关选择标志物改变，包括IFITM3、MMP-1、骨膜蛋白、LGI4和eNOS降低，以及ADAMTS-4升高，同时揭示了如GPHA2等靶标存在转录-蛋白不一致性。总之，本研究提供了DM人类角膜缘龛的全面单细胞转录组图谱，并确定了糖尿病可能损害角膜稳态和再生能力的候选分子通路和细胞群体，为糖尿病性角膜炎的治疗干预提供了潜在靶点。

**样本片段**

**人类标本**

年龄匹配且经研究同意的人类非糖尿病（N）和糖尿病（DM）供体尸检眼球和角膜（补充材料表1）在死亡后72小时内从国家疾病研究交换中心（NDRI，宾夕法尼亚州费城）或Eversight视觉和眼库研究中心（俄亥俄州克利夫兰）获取，保存于Optisol（Chiron Vision，加州克莱蒙）或类似角膜保存液中，并依据锡达-西奈医疗中心批准的IRB方案Pro00019393使用。

**单细胞分离与测序**

角膜缘单细胞转录组图谱揭示人类角膜缘存在异质性细胞类型

单细胞分选和文库制备使用10x Genomics Chromium平台进行，所得文库在Illumina NovaSeq 6000上进行测序。经过质量控制过滤、双细胞排除、批次校正和数据集整合后，共保留20240个细胞（原始29360个）用于下游分析。研究工作流程包括人类N和DM供体角膜缘组织的采集、组织解离、scRNA-seq、生物信息学整合、聚类、

**讨论**

在本研究中，我们应用scRNA-seq首次表征了糖尿病对人类角膜缘龛细胞组成、转录景观和细胞间通讯网络的影响。在先前的角膜scRNA-seq研究基础上，我们的分析鉴定了角膜缘龛内的不同细胞簇，包括LPC、LESC/VEC、MEL、IC和NCPC，揭示了角膜缘上皮的细胞异质性[19, 20, 21]。拟时间分析和亚聚类分析揭示

**结论**

总之，我们的研究提供了糖尿病相关人类角膜缘上皮和龛变化的全面单细胞图谱。我们的发现鉴定了干细胞/祖细胞转录状态、细胞外基质调控和推断的细胞间通讯以及参与上皮维持和细胞-基质信号传导的选择性蛋白质中协调的糖尿病相关差异，这些共同影响角膜缘龛稳态。这些发现不仅推进了我们的

**CRediT作者贡献声明**

Mehrnoosh Saghizadeh：写作–审阅与编辑，写作–初稿，可视化，监督，资源，项目管理，方法论，资助获取，形式分析，概念化。Jake Inzalaco：写作–审阅与编辑，方法论，调查。Andrew Fealy：写作–审阅与编辑，方法论，调查。Onkar B. Sawant：写作–审阅与编辑，资源。Andrei A. Kramerov：写作–审阅与编辑，资源，调查。Ruchi Shah：写作

**伦理声明**

已从所有参与者或其法定代表获得参与研究和发表文章的书面知情同意。已尊重参与者的隐私权。

本研究包含器官或组织供体。

本研究包含人类生物材料，已从供体或其近亲或法定代表获得用于本研究和发表文章的同意。本研究使用的样本未来源于处决

**数据共享声明**

本研究产生的scRNA-seq原始序列数据已存入基因表达综合库（GEO），登录号为GSE326016。

**利益冲突声明**

作者声明不存在利益冲突。

**资助**

本工作由NIH R01资助项目EY025377（MS）；EY029829（MS）；EY031377（AVL），EY013431（AVL）；加州再生医学研究所资助项目CIRM EDUC4-12751（DZ）；以及锡达-西奈健康科学大学董事会再生医学研究所的资助（MS）支持。

**竞争利益声明**

作者不存在利益冲突。

**致谢**

我们感谢国家疾病研究交换中心（NDRI，美国宾夕法尼亚州费城）和Eversight视觉和眼库研究中心（俄亥俄州克利夫兰）提供来自已故供体的人类角膜。Eversight的一般研究支持来自康涅狄格雄狮眼科研究基金会、Lowell F. Johnson基金会、Eppley研究基金会、William G.和Helen C. Hoffman基金会以及Louise H.和David S. Ingalls基金会。我们感激

Daxian Zha|Yizhou Wang|Ruchi Shah|Shaghaiegh M. Ebrahimi|Adam J. Poe|Cynthia Amador|Jake Inzalaco|Andrew Fealy|Onkar B. Sawant|Andrei A. Kramerov|Zhiping P. Wang|Alexander V. Ljubimov|Mehrnoosh Saghizadeh