基于One Health方法的荷兰奶山羊场金黄色葡萄球菌（S. aureus）储存库横断面研究：山羊、农场工人与环境空气尘埃及全基因组测序特征

《One Health》：A cross-sectional study of Staphylococcus aureus reservoirs in dairy goats, their environment and farm workers

　　

由金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）诱导的奶山羊乳腺炎是影响动物健康与福利并给奶山羊场带来经济负担的严重问题。S. aureus在奶山羊场的储存库及可能传播途径尚未完全明确。本研究采用One Health方法，调查荷兰奶山羊场中S. aureus的储存库。研究人员在29个奶山羊场采集样本（n = 329），来自山羊鼻腔（n = 145）、农场工人手部（n = 80）和挤奶厅奶杯（n = 54）。使用静电尘埃收集器（electrostatic dust collectors，EDCs）采集环境空气传播尘埃样本（n = 50）。样本经培养并用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, Time-Of-Flight，MALDI-TOF）分析。在27个农场检测到S. aureus，约27%样本为阳性。EDCs中检出率最高，证实空气传播尘埃是主要储存库和潜在传播途径。手部拭子阳性率最低，但提示职业暴露，尤其是在挤奶员和农场所有者中。戴手套者手部拭子阳性比例高于不戴手套者。既未进入畜舍也未接触山羊的参与者检测为阴性。全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）鉴定ST133为主要序列型（sequence type，ST）（占分离株76%），而ST398在10%分离株中检出。分离株主要按农场聚类，并跨所有样本类型聚类。总体而言，结果表明S. aureus几乎存在于所有纳入的奶山羊场，在山羊、人手和环境样本中均呈阳性。预防措施应强调生物安全、卫生和监测。

研究背景：金黄色葡萄球菌（S. aureus）是人兽共患病原体，可危害奶山羊和人类。在奶山羊中，S. aureus可致乳腺内感染并进展为临床乳腺炎（clinical mastitis，CM），亚临床和临床乳腺炎会升高羊奶细菌数，降低奶产量和质量，损害动物福利和产业经济，严重时可致死亡；S. aureus乳腺内感染与0.13 kg/day产奶损失相关。该菌储存库包括乳房和乳头皮肤、阴道黏膜，尤其鼻腔。Pals等报道，在71项综述研究中32.4%的研究显示奶山羊S. aureus所致亚临床乳腺炎比例>10%；Tibebu等报道S. aureus平均占乳腺炎相关病原体11%。S. aureus可经山羊间直接接触、污染物体/表面/空气传播尘埃等间接传播，挤奶时人接触山羊可造成山羊至人及山羊至山羊传播。ST133与小反刍动物最相关，也曾在人检出。人鼻腔和皮肤常携带S. aureus，约30%个体持续定植，多无症状，但防御受损时可致皮肤软组织感染、肺炎、菌血症、骨髓炎、心内膜炎和脓毒症等；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）感染也见于奶山羊并增加医疗成本。既往对奶山羊场储存库、环境和传播途径研究有限。本研究假设农场环境参与传播，采用One Health方法调查荷兰奶山羊场不同储存库中S. aureus流行率，并用全基因组测序（WGS）比较动物、人类和环境分离株，以加强生物安全并减少经济损失。

研究人员开展横断面研究，样本队列来源为2023年荷兰奶山羊组织（Nederlandse GeitenZuivel Organisatie，NGZO）调查中表达乳腺健康研究兴趣的奶山羊场，2025年2—5月在荷兰29个场采样，平均泌乳奶山羊1,127只。共采集n = 329份样本：山羊鼻腔145份、农场工人手部80份、挤奶厅奶杯54份，并用静电尘埃收集器（EDCs）采集空气传播尘埃50份。样本经培养和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）鉴定，分离株行WGS并以核心基因组多位点序列分型（cgMLST）聚类（阈值≤25）。统计分析采用Pearson卡方检验和Bonferroni校正；人类手部风险因素仅作描述性统计。动物样本获Utrecht动物福利伦理委员会批准，医学研究伦理委员会判定研究不属于荷兰WMO（Medical Research Involving Human Subjects Act）范围。

研究结果：29个农场中平均每场采集11.3 ± 1.1份样本，每份样本平均2.1 ± 1.0种菌落形态；2个农场（6.9%）无阳性样本。全部样本中88份（26.7%）为S. aureus阳性，15%无细菌生长；每场阳性比例0.0%—58.3%（均值26.3%，SD 15.8%）。挤奶厅和深垫料畜舍的空气传播尘埃阳性比例>50%，高于山羊鼻腔、手部和奶杯拭子（p < 0.001）；48%农场有1份阳性尘埃样本，36%有2份，16%无。WGS鉴定ST133最常见（76.8%），其次ST398（9.8%）、ST7（2.4%）、ST45（1.2%）、ST97（1.2%），8.5%未指定ST。ST7和ST45见于除山羊鼻腔和空气传播尘埃外的样本，ST398见于除空气传播尘埃外的样本。山羊鼻腔、人手、奶杯和EDCs分离株常聚于同一簇，无来源间清晰分离，而同农场分离株更常聚类；共14个农场水平簇，71%仅含1个农场，29%含多个农场；73%（60/82）样本位于簇内，22份未聚类。对5份样本测多个分离株，部分相同、部分遗传不同；4个所有样本聚于单簇的农场中，样本类型间遗传距离无一致模式。80名手部拭子参与者中，多数访问山羊和羔羊畜舍、停留2—4 h、直接接触且不戴手套，多数为农场所有者并从事一般任务；戴手套者手部阳性17.4%，不戴手套者9.1%；既未进畜舍也未接触山羊者均为阴性。

讨论部分：
4.1 S. aureus流行率：S. aureus在荷兰奶山羊场普遍存在，仅2/29农场全阴性，与既往85%山羊场散装奶罐阳性一致；平均阳性27%。即使无临床症状，农场主也应假定存在，因亚临床乳腺炎难以检测，可能未被察觉传播。
4.2 环境传播：空气传播尘埃阳性显著高于其他类型，深垫料畜舍与挤奶厅无差异；EDCs采集5—7天尘埃，而拭子仅单一时点。尚无奶山羊场EDCs检测S. aureus的已发表研究，但结果与猪场等EDCs检测MRSA一致。未来应区分清洁/未清洁奶杯和手部。
4.3 全基因组测序：同一簇内跨山羊鼻腔、人手、奶杯和尘埃提示这些位点在农场内密切关联，人类、动物和环境间可能交换菌株；聚类 largely 农场特异性，提示农场内循环而非农场间广泛共享。同簇农场在地理位置、群规模和羔羊饲养策略上无明确相似性；未来可探索购买山羊、饲料供应商或兽医等共同因素。ST133跨样本类型支持优势株；既往ST133和ST398见于小反刍动物，ST133最常见。ST398传统为livestock-associated，但日益引起人感染；ST133在人类疾病中作用不明。WGS提示同一农场内存在遗传相关分离株，传播主要发生在农场内。
4.4 人类暴露和风险因素：参与者访问畜舍、停留时间、接触、手套使用、角色和任务仅作描述性统计。空气传播尘埃高流行提示农场工人和居民可能反复暴露；猪和犊牛养殖中空气MRSA浓度与农民携带相关，奶山羊场是否类似尚待研究。多数进畜舍者不戴手套；Menzies建议挤奶使用一次性手套，但需正确指导和培训，错误做法和虚假安全感可能促进传播。
4.5 优势：地理代表性广；各场采样数量相近减少偏倚；现场直接观察和采样；培养法验证细菌活力；WGS提供高分辨率遗传数据。
4.6 局限性：奶杯内外表面同时采样，未来需区分；人仅采手未采鼻，可能低估流行率；2个农场由农场主采样，技术差异可能引入变异；培养联合MALDI-TOF较粗略，Bacillus优势生长可能掩盖S. aureus，敏感性不确定；统计未将农场作为独立组，未考虑农场特征和观察依赖性。

研究结论翻译：本研究采用One Health方法调查荷兰奶山羊场S. aureus储存库和可能传播途径。研究表明S. aureus可能存在于几乎所有荷兰奶山羊场，并在奶山羊、人类和农场环境中检出；最常见于深垫料畜舍和挤奶厅EDCs上的空气传播尘埃，最少见于农场工人/居民手部拭子和奶杯拭子。WGS结果提示S. aureus在农场内跨山羊、人类和环境循环，特定菌株占优势。这些发现强调传播可能具有农场特异性，尘埃和其他环境储存库促进传播，控制策略不仅应针对动物，还应针对农场环境；关注卫生实践、环境管理和挤奶程序的措施可能对限制传播至关重要。探索粉尘较少的其他垫料材料和通风策略等风险因素，将有助于进一步理解传播途径。