噁菌酯在大豆疫霉氧甾醇结合蛋白中的作用机制与抗性的计算与实验研究

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Computational and experimental insights into the mode of action and resistance of oxathiapiprolin in Phytophthora sojae oxysterol-binding protein

　　

摘要

Phytophthora sojae（大豆疫霉）是一种破坏性极强的卵菌病原体，严重损害大豆生长并造成巨大的农业损失。噻呋酰胺（OXA）是一种效力极强的杀菌剂，靶向卵菌中的氧甾醇结合蛋白（OSBP），已被广泛用于控制大豆根腐病。然而，OXA 抗性突变体的不断出现对其田间持续 efficacy 构成了重大威胁。在本研究中，我们整合了多尺度计算方法——包括分子对接和分子动力学模拟——与生化测定，以阐明 OXA 在Phytophthora sojae OSBP（PsOSBP）内的结合模式及其抑制机制。我们鉴定了介导 OXA 与 PsOSBP 原位相互作用的几个关键残基，并为其功能意义提供了实验证据。此外，我们的结果表明，这些关键位点的突变通过改变局部蛋白质构象而赋予抗性，特别是 PsOSBP β -桶状口袋的几何形状、体积波动和入口动力学，从而降低 OXA 的结合亲和力。本研究阐明了 OXA 抑制 PsOSBP 活性的机制，以及抗性突变体如何破坏这种抑制作用。这些发现不仅为 OXA 的作用模式提供了深刻的机制见解，还有助于理性设计下一代杀菌剂以缓解杀菌剂抗性，从而支持大豆的可持续生产。

引言

Phytophthora sojae（P. sojae）是Phytophthora属中一种土传植物致病卵菌，感染大豆根和茎，引起严重的根茎腐病，对全球粮食生产和农业可持续性构成重大威胁（Dorrance et al., 2009）。P. sojae分布于包括澳大利亚、美国、德国、英国、日本和中国在内的 20 多个国家，造成的全球年度经济损失估计为 10 亿至 20 亿美元（Tyler, 2007）。

噻呋酰胺（OXA, CAS: 1003318-67-9），由杜邦公司开发（Pasteris et al., 2016），是对包括P. sojae、P. capsici和P. infestans在内的广泛谱卵菌病原体最具效力的抑制剂之一（Wang et al., 2023; Miao et al., 2016a; Cohen et al., 2018）。根据 Wang et al. (2023) 的研究，OXA 对P. sojae表现出卓越活性，其 EC₅₀值范围为 1.15 × 10^?4 至 4.43 × 10^?3 μg/mL，并通过破坏膜完整性和调节渗透及细胞壁胁迫反应，抑制多个发育阶段——菌丝生长、孢子囊形成、卵孢子产生和游动孢子释放，从而有效控制大豆根腐病。

氧甾醇结合蛋白（OSBP）是一种保守的脂质转运蛋白，对许多真核细胞过程至关重要，包括信号转导、囊泡运输、脂质代谢和非囊泡甾醇运输。OSBP 定位于内质网（ER） - 高尔基体连接位点，介导甾醇和磷脂酰肌醇 4-磷酸（PI(4)P）的逆向交换（Mesmin et al., 2013; Liu et al., 2026），从而对脂质稳态发挥根本作用。OSBP 功能障碍已被证实与多种人类疾病有关，如病毒感染、脂肪肝疾病、糖尿病、溶酶体障碍和癌症（Lin et al., 2023）。Pasteris et al. (2016) 证明 OXA 精确靶向卵菌 OSBP，从而强力抑制病原体生长。然而，随着 OXA 在田间使用的扩大，抗性病株的报道日益增多。例如，Miao et al. (Miao et al., 2016a; Miao et al., 2016b; Miao et al., 2018) 在P. capsici中鉴定出中度耐药风险（抗性因子 > 300），其中 OSBP 中的突变——如 G769W、G770V 和 G839W——显著降低 OXA 敏感性，后两者也出现在P. sojae OSBP（PsOSBP）中。随后，又鉴定出另外 18 个与不同程度抗性相关的 PsOSBP 突变（Miao et al., 2020）。这些发现突显了阐明 OXA 抑制 PsOSBP 机制以及理解突变如何赋予抗性的紧迫需求。

在本研究中，我们利用同源建模构建了 PsOSBP 的三维结构，并采用分子动力学模拟结合生化测定，以阐明 PsOSBP 中 OXA 识别与抗性的分子机制。尽管之前已报道 OXA 靶向卵菌 OSBP 及若干与抗性相关的突变，但 OXA 结合及突变介导抗性的构象基础仍知之甚少。因此，我们重点关注了三个代表性替换，L673W、S708F 和 L803W，并分析了它们对 OXA 结合口袋、β -桶状稳定性、口袋体积和腔体入口动力学的影响。

我们的结果鉴定了 PsOSBP β -桶状内的两种不同结合模式，并表明 OXA 结合稳定了 β -桶状腔，可能限制胆固醇等底物的进入。我们鉴定了参与 OXA 结合的八个关键热点残基——E662、L673、S708、W762、M773、L800、L803 和 I805。基于先前报道的发现（Miao et al., 2020）及我们对关键氨基酸的分析，我们选择了三个代表性突变——L673W、S708F 和 L803W——来研究 OXA 抗性背后的机制。我们进一步证明，这三个与抗性相关的突变通过不同机制干扰 OXA 识别。L673W 促进 β5 的重排和向外位移，并增加其灵活性，从而扩大相邻口袋。S708F 诱导紧凑的口袋和封闭的入口。而 L803W 结合了局部限制下部口袋区域与增强口袋和入口动力学。这些发现为抗性相关突变如何损害 PsOSBP 中 OXA 结合提供了结构和动力学解释。

章节片段

同源建模和分子对接

使用 RoseTTAFold（Baek et al., 2021）根据 PsOSBP 序列生成了 PsOSBP（残基：600–967）的 3D 结构。我们选择了评分最高的模型（0.804），并使用 PROCHECK（Laskowski et al., 1993）通过在线服务器 SAVES（https://saves.mbi.ucla.edu/）上的拉氏图评估其质量。然后使用与胆固醇复合物中的人 ORP1-ORD 结构（PDB: 5ZM5 (Dong et al., 2019)）作为结构参考。尽管序列一致性很低

OXA 结合后 PsOSBP β -桶状结构稳定性的观察

拉氏图（图 S1）显示，RoseTTAFold 建模的 PsOSBP 中 99.7% 的残基位于允许区域，0.3% 位于不允许区域，表明该结构适用于后续的分子对接和 MD 模拟。对接揭示了野生型 PsOSBP β -桶状内的两种潜在 OXA 结合姿态（图 1）：姿态 1 的对接评分为 ?4.5 kcal/mol，对应于一种“向下”构象，其中 OXA 的苯环指向底部

讨论

卵菌是一类重要的真核丝状病原体，已知物种中有超过 60% 是植物寄生的（Thines and Kamoun, 2010）。其中，Phytophthora属物种破坏性尤为严重，对农业、林业、观赏植物和自然生态系统造成严重损害。例如，Pseudoperonospora cubensis（P. cubensis）引起瓜类霜霉病（Lebeda and Cohen, 2011），而P. capsici导致辣椒疫病——两者均为主要

结论

本研究为噻呋酰胺（OXA）对Phytophthora sojae氧甾醇结合蛋白（PsOSBP）活性的抑制机制以及药代突变体如何破坏该效应提供了见解。通过整合结构和生化分析，我们发现 OXA 的效力取决于 PsOSBP β -桶状的诱导收缩，而疏水腔的动态关闭是抑制必需脂质交换的根本。此外，我们对已知

CRediT 作者贡献声明

Yiqiong Bao: 撰写 - 原稿，方法学，调查，形式化分析。Chaoqi He: 调查，形式化分析。Xian Ding: 调查，形式化分析。Tianli Liu: 调查。Wei Yu: 调查。Jiaxing Yan: 调查。Wenwu Ye: 调查。Hongliang Duan: 调查。Feng Zhang: 撰写 - 审阅与编辑，监督，项目管理，方法学，资金获取，概念构思。Jingjing Guo: 撰写 - 审阅与编辑，监督，软件，

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本论文中报告的工作。

致谢

本工作由国家重点研发计划（2022YFD1700202），海南省科技专项资金（ZDYF2023XDNY034），江苏省社会科学基础研究专项资金（BZ2024056），澳门理工科大学内部资助（RP/CAI-01/2023）支持。

Yiqiong Bao|Chaoqi He|Xian Ding|Tianli Liu|Wei Yu|Jiaxing Yan|Wenwu Ye|Hongliang Duan|Feng Zhang|Jingjing Guo

南京农业大学植物保护学院农业林业生物安全国家重点实验室，南京 210095，中国