磷硫酰化基因簇(dnd/ssp)在铀胁迫下的保护作用与代谢重编程机制

《Radiation Medicine and Protection》：Protective role of phosphorothioation gene clusters under uranium stress

　　

： 铀(U)是一种天然存在的放射性重金属，因其长半衰期和环境持久性而广泛分布于环境中，对生态系统和人类健康构成显著风险。本研究通过在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达来自沙门氏菌(Salmonella)菌株Se87的dndBCDE基因簇和来自弧菌(Vibrio)菌株FF75的sspABCD基因簇，构建了DNA磷硫酰化(phosphorothioation, PT)修饰系统，并结合非靶向代谢组学(untargeted metabolomics)分析，系统研究了PT修饰在铀胁迫下调控细胞活力和代谢反应中的作用。结果显示，在不同铀浓度(0–1000 μmol/L)和暴露时间(0–24 h)条件下，表达dndBCDE或sspABCD的重组菌株的细胞活力显著高于空载体对照菌株。活/死染色和菌落形成单位(colony-forming unit, CFU)计数进一步证实了PT基因簇对细菌存活的保护效应。此外，铀暴露导致对照菌株中活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平显著升高，而在PT表达菌株中未观察到ROS的显著增加。代谢组学分析表明，PT修饰诱导了显著的代谢重编程，特别是在苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)和氨基酸代谢途径中。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析和基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)进一步揭示，dnd和ssp基因簇的表达改变了铀胁迫下能量代谢、抗氧化防御和氨基酸生物合成等通路的富集模式。研究表明，PT基因簇通过减轻氧化应激和重塑代谢网络增强细菌对铀毒性的耐受性，为理解PT修饰在放射性重金属胁迫下的生物学功能提供了新见解，并为基于微生物的铀污染修复策略开发奠定了基础。

论文解读

一、研究背景与科学问题

铀(Uranium, U)是一种天然存在的放射性重金属，广泛分布于地壳环境中，并通过核燃料循环、军工制造及相关工业过程大量释放进入生态系统。由于铀具有极长的半衰期和环境持久性，其化合物可在水体和土壤中长期残留，易于迁移并沿食物链累积，对水生生物的生长、繁殖和发育造成损害，破坏微生物群落结构，改变受污染环境中的生物地球化学循环。在人体健康层面，铀主要通过化学毒性和辐射效应产生危害：化学毒性方面，慢性暴露尤其是通过受污染饮用水摄入时，铀主要靶向肾脏，诱发肾毒性、氧化应激和肾小管损伤；辐射效应方面，长期内暴露通过吸入或摄入含铀颗粒可增加致癌和遗传损伤的风险。流行病学和实验研究还表明，铀暴露对骨骼系统、生殖功能和免疫应答均有不良影响。

针对铀污染的治理策略已从传统的物理化学吸附逐步转向生物驱动的环境友好型方法，其中微生物修复成为主导研究方向。然而，微生物修复的实际应用仍面临诸多挑战，包括环境适应性有限、生物还原铀稳定性不足、易受共存污染物干扰以及修复效率受限等问题，亟需进一步的优化和机制解析。

微生物是环境中最早感知和响应重金属及放射性污染的生物学实体之一，其耐受和适应机制对于环境辐射防护和生物修复研究具有重要意义。DNA磷硫酰化(DNA phosphorothioation, PT)是一种由特定基因簇介导的新型表观遗传修饰，涉及DNA磷酸二酯键中非桥连氧原子被硫原子取代。目前已发现两类PT修饰系统：由dnd基因簇介导的I型系统和由ssp基因簇介导的II型系统。已有证据表明PT修饰具有抗氧化特性，参与外源DNA识别与防御。然而，PT修饰在放射性重金属如铀暴露下的生物学功能尚不清楚。

因此，研究人员开展本研究的目的是：在大肠杆菌(Escherichia coli)中构建dnd和ssp磷硫酰化基因簇的异源表达系统，结合非靶向代谢组学分析，系统探究PT修饰在铀胁迫下调控细胞活力和代谢反应的作用，阐明PT介导的抗逆机制基础，为PT修饰在铀胁迫下的生物学功能提供新见解。

二、研究设计与技术方法

研究人员从携带PT基因簇dndBCDE的沙门氏菌(Salmonella)菌株Se87和携带sspABCD的弧菌(Vibrio)菌株FF75中扩增目标基因簇，将其克隆至pBluescript SK(+)载体，并在大肠杆菌DH10B中进行异源表达。关键技术方法包括：采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法测定不同铀浓度(0、250、500、750、1000 μmol/L)和不同暴露时间(0、2、4、8、12、24 h)下的细菌活力；利用活/死荧光染色和菌落形成单位(colony-forming unit, CFU)计数独立验证细胞存活率；使用活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)检测试剂盒测定细胞内ROS水平；采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行非靶向代谢组学分析，鉴定差异代谢物并进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析和基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)。

三、研究结果

3.1 铀胁迫下PT表达菌株的细胞活力

所有大肠杆菌菌株在铀暴露后均表现出浓度和时间依赖性的细胞活力下降。但在所有测试铀浓度(0–1000 μmol/L)和暴露时间点(2、8、12、24 h)，表达dndBCDE或sspABCD的重组菌株的活力始终高于空载体对照菌株。低铀浓度下差异相对温和，但随着铀浓度升高和暴露时间延长，dnd和ssp基因簇的保护效应更加明显，尤其在750和1000 μmol/L高浓度下，12和24 h时重组菌株维持了显著更高的活力。活/死染色和CFU计数结果一致验证了这一结论，表明这种增强的存活并非仅由CCK-8测量的代谢活性变化引起，而是反映了细菌在铀胁迫下实际生存能力的提升。铀暴露显著增加了对照菌株的细胞内ROS水平，而dndBCDE和sspABCD表达菌株在铀暴露后未观察到ROS水平的显著升高，提示PT基因簇可能缓解了铀诱导的氧化胁迫。

3.2 铀胁迫下与PT基因簇相关的差异代谢物

火山图分析显示，在500 μmol/L铀浓度下，dnd和ssp表达菌株的代谢物水平相较于野生型发生显著变化。dnd表达菌株与野生型比较，下调代谢物数量较多，其中腺苷单磷酸(adenosine monophosphate, AMP)等核苷酸及其衍生物尤为突出，提示核苷酸代谢可能发生重塑。ssp表达菌株与野生型比较，最显著的变化集中在与氧化还原稳态相关的代谢物上，谷胱甘肽(glutathione)和硫代硫酸盐(thiosulfate)等含硫化合物显著下调。热图分析进一步显示，铀胁迫下ATP和NADH等能量代谢相关代谢物普遍下调，而胁迫响应代谢信号显著上调。全局聚类模式表明，PT基因簇的引入与一种独特的重编程代谢状态相关联，与野生型反应显著不同。

3.3 KEGG通路富集分析

在500 μmol/L铀浓度下，野生型大肠杆菌中DNA修复、抗氧化和能量代谢通路发生变化，DNA修复代谢物上调，抗氧化代谢物增加。在dnd和ssp菌株与野生型在铀胁迫下的比较中，出现了不同的富集模式。两种工程菌株中，苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)的富集更为显著，提示其为PT介导适应的关键节点。硫代谢(map00920)和半胱氨酸/蛋氨酸代谢(map00270)在dnd和ssp之间呈现差异富集，表明两个PT系统调节了氨基酸和硫网络中相关但不同的分支。糖酵解/糖异生(map00010)和三羧酸循环(TCA cycle, map00020)等能量通路也表现出改变的富集模式，表明中心碳代谢发生了全局性转变。

3.4 基因集富集分析

在500 μmol/L铀浓度下，野生型大肠杆菌中DNA修复、抗氧化和能量代谢通路出现显著富集，DNA修复通路的关键代谢物显著富集，表明这些模块在应对铀胁迫时协同上调。在dnd和ssp表达菌株中，这些代谢通路的富集模式发生了显著改变。GSEA揭示了单独差异代谢物分析未能完全捕获的整个通路的协调性转变。

四、讨论与结论

研究结果表明，在不同浓度铀暴露下，dnd和ssp表达菌株的存活能力显著高于野生型菌株，表明PT修饰有助于增强细胞对铀毒性的耐受性。这一发现与先前关于微生物适应铀胁迫涉及复杂胁迫响应网络的报道一致，包括代谢调整和细胞保护机制。与经典研究中主要关注胞外U(VI)还原为U(IV)的机制不同，本研究结果表明已知的PT修饰系统在铀胁迫下发挥作用，并进一步提示了这种DNA修饰与代谢重编程之间的新联系，拓展了PT系统的潜在功能范围。

代谢组学分析揭示，铀胁迫显著改变了细胞内代谢谱，代谢重编程在PT介导的抗性中发挥关键作用。苯丙氨酸代谢中差异代谢物的富集值得关注，因为苯丙氨酸及其下游代谢产物已知参与抗氧化防御和胁迫相关化合物的生物合成，能够清除活性氧并减轻氧化损伤。这表明PT修饰可能至少部分通过协调氨基酸代谢来对抗氧化胁迫，从而增强铀耐受性。

重要的是，先前研究已证明PT修饰本身具有内在抗氧化特性，能够清除羟基自由基并保护DNA免受氧化损伤。在此基础上，本研究发现提供了新的证据，表明PT修饰不仅保护基因组完整性，还在铀胁迫下重塑细胞代谢网络。与早期主要强调PT系统遗传防御作用的报告相比，本研究突出了其在代谢调控中的更广泛功能。代谢组学水平观察到的协调性变化进一步表明，PT修饰作为一种全局性调控机制而非针对单一代谢通路发挥作用。

尽管PT修饰传统上被视为以DNA为中心的防御机制，但越来越多的证据表明DNA修饰可通过改变基因组稳定性、转录调控和胁迫响应网络来影响细胞生理。在铀暴露下，基因组完整性的维持可能减少DNA修复所需的细胞资源，使代谢流向重新导向胁迫适应和存活相关通路。因此，PT表达菌株中观察到的代谢重塑可能代表了与PT介导的基因组保护相耦合的次级适应性响应。

综上所述，本研究揭示了PT相关基因簇与细菌在铀胁迫下适应之间的此前未被充分认识的联系。与依赖直接金属转化或吸附的传统微生物修复机制不同，dndBCDE和sspABCD表达相关的保护效应涉及内在细胞响应，包括代谢重编程和铀诱导氧化胁迫的缓解。铀暴露显著增加了对照菌株的细胞内ROS水平，而dndBCDE和sspABCD表达菌株中未观察到ROS显著升高，表明PT相关系统可能通过协调代谢适应与细胞氧化还原稳态来促进铀耐受性。研究结论为：PT基因簇通过减轻氧化胁迫和重塑代谢网络增强细菌对铀毒性的耐受性，为理解PT修饰在放射性重金属胁迫下的生物学功能提供了新见解，并为基于微生物的铀污染修复策略开发奠定了理论基础。