基于微图案化几何限定的表面等离子体共振成像（SPRI）无标记单细胞动态响应定量生物传感平台

《Sensing and Bio-Sensing Research》：Micropatterned surface plasmon resonance imaging platform for single-cell biosensing

微图案化表面等离子体共振成像平台用于单细胞生物传感。无标记表面等离子体共振成像（SPR imaging）生物传感器用于单细胞响应的定量分析。通过基底微图案化实现几何定义的单细胞阵列。刺激特异性单细胞响应特征的定量分析。异质性和动态细胞行为的空间分辨分析。

研究背景与问题：无标记技术已用于实时、非侵入监测细胞对生化刺激的响应，可避免荧光标记或抗体带来的扰动。表面等离子体共振成像（surface plasmon resonance imaging, SPRI）等倏逝场光学方法对基底附近折射率变化敏感，已用于单细胞黏附、形态动力学和生化表型分析。然而，群体平均分析会掩盖细胞异质性；传统单细胞SPRI的感兴趣区域（region of interest, ROI）多依赖细胞轮廓，细胞形态差异会影响定量比较。微图案化黏附基底可控制细胞形状和尺寸，产生均一细胞形态，为单细胞定量比较提供受控几何框架。研究人员因此将SPRI与基底微图案化结合，在几何限定条件下定量监测单个细胞对细胞骨架、氧化应激和受体介导刺激的动态响应。

关键技术与方法：在BK7玻璃上依次沉积3 nm钛和30 nm金制备SPR芯片；PEG-thiol钝化后，经石英光掩模UV光刻制作面积750 μm²、直径约30.9 μm、间距25 μm的圆形黏附区，并以纤连蛋白包被。使用EA.hy926内皮细胞（CJ Edgell, University of North Carolina, USA），接种后稳定48 h。SPRI系统采用740 nm TM偏振光、高数值孔径油浸物镜、69.2°工作角、CMOS相机，采集频率1 frame s^?1。刺激条件为对照、10 μM细胞松弛素B（cytochalasin B）、100 μM过氧化氢（H₂O₂）和10 U/mL凝血酶（thrombin）；用Python脚本分析ROI平均反射率、差分热图和绝对反射率变化ΔR_abs。

研究结果：
3.1 微图案化SPR基底的制备与表征：研究人员通过PEG-thiol钝化、UV光刻和纤连蛋白吸附制备微图案基底。由于纤连蛋白与PEG背景折射率差异小，单独明场或SPRI难以显现图案；Coomassie Brilliant Blue染色后，SPRI检测到染料诱导的折射率变化，验证了光刻和纤连蛋白沉积。接种EA.hy926细胞后，SPR亮圆区域对应细胞占据的微图案，明场图像证实亮区为黏附细胞，空图案无信号；DAPI核染显示每个微图案内为单核占据。结论是该基底可将单细胞限制在预定黏附区，并形成标准化ROI。
3.2 微图案中固定细胞的SPR稳定性评估：利用已知微图案几何手动放置800 μm²圆形ROI，记录30 min基线。单细胞基线反射率时间标准差均值为0.65±0.24%，波动与膜波动和细胞骨架重塑等细胞-基底界面固有动态一致。结果表明，几何限定细胞可产生稳定基线反射率信号，适合定量单细胞分析。
3.3 单细胞SPR定量揭示刺激特异性动力学响应：无细胞微图案背景除注射瞬变外迅速回到基线。对照条件仅见轻微、非同步波动，平均反射率变化为?1.43±0.83%，细胞内波动为0.64±0.24%。细胞松弛素B引起快速反射率下降，平均降至?4.0±1.4%，多数细胞稳定在?3.9±1.4%平台，稳态标准差（standard deviation, SD）为0.12±0.07%，提示肌动蛋白解聚和膜部分脱附；一个ROI持续下降，类似凋亡或脱附细胞。H₂O₂引起延迟约2 min的下降，最低值为?7.9±5.1%，随后部分恢复至0.4±3.3%平台，稳态SD为0.8±0.5%，细胞间异质性大，符合阈值依赖的氧化还原重塑、酶解毒和修复。凝血酶引起同步急性升高，峰值为3.8±2.6%，随后最低值为?2.9±3.1%，再恢复至4.2±2.5%平台，稳态SD为0.9±1.0%，提示PAR1激活及膜-基底界面分子重排。研究人员用Peak、Minimum、Plateau和SD四个指标比较，发现凝血酶峰值显著高于对照，细胞松弛素B和H₂O₂的最低值较对照显著下降，H₂O₂平台回到对照水平，凝血酶平台显著升高，细胞松弛素B持续降低并显著抑制稳态波动。
3.4 单细胞响应空间映射及ROI内空间反射率变化定量：差分SPR热图以注射前1 min为参考，显示+3、+6和+26 min变化。对照条件无明显空间变化；细胞松弛素B使全细胞区域倾向出现蓝色信号，表现为整体反射率下降；H₂O₂在+3和+6 min出现外周蓝色降低和中央相对红色或稳定区域，+26 min多数细胞部分恢复；凝血酶在+3 min出现中央强正变化，+6 min出现外周瞬时损失，+26 min多数细胞整体升高。由于正负像素在平均时会抵消，研究人员计算每像素绝对反射率变化ΔR_abs。对照最大值为139±26 A.U.，细胞松弛素B为120±19 A.U.，H₂O₂为255±75 A.U.，凝血酶为189±39 A.U.。H₂O₂和凝血酶最大值显著高于对照，细胞松弛素B与对照无显著差异；四分位距（interquartile range, IQR）显示H₂O₂异质性最明显。该幅度加权分析捕获了平均反射率分析未完全反映的空间折射率重分布。

讨论总结：微图案化限定了单细胞几何，提供可重复细胞定位和标准化ROI，同时保留细胞对生化刺激的功能响应性。不同刺激产生不同动力学和空间签名：细胞松弛素B为快速持续下降；H₂O₂为延迟、异质、部分可逆的双相响应；凝血酶为快速同步升高并稳定于较高平台。空间映射可解析亚细胞模式，如均一降低、外周重分布和中心起始重塑。该方法将物理标准化与生物学相关性结合，为单细胞水平的无标记、高内涵药理学和生化响应研究提供平台；所用微图案尺寸针对EA.hy926细胞，其他铺展面积或形态差异大的细胞类型可能需要调整。

研究结论翻译：本研究提出了一种结合表面等离子体共振成像（SPRI）与基底微图案化的策略，为基于预定黏附几何、可重复细胞定位和标准化ROI定义的单细胞生物传感提供受控框架。通过将细胞限制在限定面积的圆形纤连蛋白包被黏附位点内，该方法定义了用于SPR分析的一致空间域，同时保留细胞功能响应性，从而使动态单细胞对生化刺激的响应可直接定量比较。此处使用的微图案尺寸针对EA.hy926细胞选择，可能需要对铺展面积或形态差异显著的细胞类型进行调整。在该标准化配置中，细胞在所受扰动下表现出不同的动力学和空间特征。细胞松弛素B诱导平均反射率快速且持续下降，符合肌动蛋白网络破坏及细胞-基底界面相关结构变化。过氧化氢（H₂O₂）引发延迟、异质且部分可逆的双相响应，符合阈值依赖性氧化还原重塑过程，并可能涉及胞内缓冲机制。该异质性通过单细胞响应分布加宽的IQR定量捕获。凝血酶触发反射率快速且同步增加，随后稳定在升高平台，符合快速凝血酶诱导信号及相关的细胞骨架和形态重组。空间映射显示，这些响应与特征性亚细胞模式相关，从细胞松弛素B下的均一性下降，到H₂O₂下的外周重分布，再到凝血酶下的中心起始重塑，说明微图案化配置能够在预定分析几何内解析空间不同的细胞响应。用于进一步量化折射率重分布总程度的幅度加权分析显示，H₂O₂和凝血酶相对于对照诱导了显著更大的绝对光学变化，而平均反射率分析未完全捕获该效应，并通过IQR量化了相关细胞间异质性。总体而言，这些发现证实，限制在预定黏附几何内的细胞仍对生化刺激保持响应，且将SPR成像与微图案化限制相结合，为单细胞动态的定量和多层表征提供了标准化框架。该方法将物理标准化与生物学相关性连接起来，为单细胞水平的药理学和生化响应的无标记、高内涵研究提供了平台。