新型合成3-羟基吲哚-2-酮衍生物在BALB/c小鼠中的急性及28天重复经口给药毒性评价

《Toxicology Reports》：Acute and 28-day repeated-dose oral toxicity of a synthetic 3-hydroxyindolin-2-one derivative in BALB/c mice

　　

摘要专业翻译 新合成生物活性分子的临床前安全性评价是药物研发过程中的关键步骤。本研究在BALB/c小鼠中，采用序贯剂量急性经口毒性/耐受性评估和28天重复给药研究，评价了合成的3-羟基吲哚-2-酮衍生物7-溴-3-羟基-3-(2-氧代-2-(对甲苯基)乙基)吲哚-2-酮（4b）的急性及亚急性经口毒性。在急性经口评估中，化合物4b按2000、1000和300 mg/kg体重的剂量序贯给药，随后进行14天观察期。在2000和1000 mg/kg剂量下观察到死亡，而在300 mg/kg剂量下未观察到死亡；亚急性毒性通过每日15、30和60 mg/kg的经口剂量连续给药28天确定。研究人员对合成化合物进行了体重、血液学参数、生化参数、大体病理检查及主要器官组织病理学评价。在急性观察期及28天重复给药研究期间，300 mg/kg剂量下未观察到死亡，在所检测剂量下未观察到与治疗相关的大体病理改变。重复给药后，个别血液学和生化参数观察到若干统计学显著差异及与参考区间的偏离。然而，这些变化在雌雄动物间未呈现一致的剂量-反应模式，且未伴随一致的临床、大体病理或组织病理学发现。对溶媒对照组和高剂量组选定器官的组织病理学评价显示组织架构保存完好，在所检组织中未发现与治疗相关的病变。综上，这些结果表明，在所给剂量下，合成化合物4b未引起死亡或明确的与治疗相关的血液学、生化、大体病理或组织病理学效应。

论文主体内容解读

一、研究背景与意义

抗菌药物耐药性（AMR）的迅速出现和广泛传播已被认定为全球最重大的健康威胁之一，迫切需要寻找更有效且更安全的新型治疗药物。3-羟基吲哚-2-酮（靛红）衍生物作为一类杂环化合物，因其具有抗氧化、抗真菌、抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种生物活性而受到药物化学领域的广泛关注。对靛红母核进行结构修饰已被证明是改善其药理特性和拓展治疗潜力的有效策略，在不同位置引入适当取代基可产生具有增强生物活性、改善靶点选择性和有利理化特征的衍生物。其中，溴代3-羟基吲哚-2-酮衍生物因其广谱药理活性而备受关注。研究人员前期研究已发现7-溴-3-羟基-3-(2-氧代-2-(对甲苯基)乙基)吲哚-2-酮（4b）对致病菌具有良好抗菌活性，具有作为先导抗菌候选药物的潜力，但其体内安全性尚未见报道。因此，在进一步药理学开发之前，开展全面的毒理学评价至关重要。本研究旨在BALB/c小鼠中考察化合物4b的急性及28天重复经口给药毒性。BALB/c小鼠因其遗传背景和稳定性特别适用于新型候选药物的毒性评价。OECD测试指南为急性和重复给药毒性评价提供了标准化方法，其中OECD TG 425描述了急性经口毒性的上下法程序，OECD TG 407涉及28天重复经口给药毒性。

二、研究设计与技术方法

研究人员采用序贯剂量急性经口毒性/耐受性评估和28天重复给药研究两大技术路线。急性评估参照OECD TG 425的一般方法学原则进行，但并非完全符合该指南的上下法程序。动物购自印度泰米尔纳德邦Mass Biotech Chengalpattu（CPCSEA注册号：2084/PO/RcBt/S/19/CPCSEA），使用8周龄、体重25-30 g的雌雄BALB/c小鼠。急性实验中，化合物4b按2000、1000和300 mg/kg体重的剂量序贯经口给药，另设3% DMSO溶媒对照，观察期为14天。28天重复给药研究参照OECD TG 407设计，将40只小鼠（雌雄各20只）随机分为4组，每组10只（每性别5只），分别接受溶媒对照和15、30、60 mg/kg/天剂量的化合物4b，连续给药28天。研究终点包括每日毒性观察、每周体重记录、每日摄食饮水测定、血液学和生化参数分析、大体尸检及选定器官的组织病理学检查。血液学参数涵盖血红蛋白（Hb）、白细胞（WBC）计数、血小板、红细胞（RBC）、中性粒细胞、淋巴细胞、红细胞压积（PCV）、嗜酸性粒细胞、单核细胞、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、平均红细胞体积（MCV）和嗜碱性粒细胞。生化参数包括血糖、尿素、肌酐、天冬氨酸氨基转移酶（AST/SGOT）、尿酸、丙氨酸氨基转移酶（ALT/SGPT）、总胆红素、碱性磷酸酶、HDL胆固醇、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、球蛋白、甘油三酯、LDL和VLDL，以及钠、氯、钾和碳酸氢盐等电解质参数。组织病理学评价在溶媒对照组和高剂量组（60 mg/kg/天）各5只雌雄小鼠中进行，共20只动物，中间剂量组未进行组织病理学检查。统计学分析采用双因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验，P<0.05为差异有统计学意义。

三、研究结果

3.1 序贯剂量急性经口毒性/耐受性评估

在急性评估中，初始2000 mg/kg剂量给药后观察到死亡，随后1000 mg/kg剂量也观察到死亡。基于高剂量下的死亡情况，剂量进一步降至300 mg/kg。在整个14天观察期内，300 mg/kg剂量下未记录到任何异常行为、身体变化、死亡或与治疗相关的不良反应，小鼠表现出正常行为、摄食和健康外观。尸检显示器官结构和形态无异常。该剂量因此作为后续28天重复给药研究选择较低剂量的经验依据。

3.2 血液学和生化分析

急性300 mg/kg给药后，多项血液学和生化参数与溶媒对照组相比存在统计学显著差异。血液学方面，RBC、WBC、MCHC和血红蛋白接近所述生理范围，而血小板计数、MCV、MCH、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞超出参考区间。生化方面，总胆红素、SGOT、SGPT、总蛋白、球蛋白、血糖、尿素、总胆固醇和甘油三酯在参考区间内无明显变化，ALP高于参考范围，而白蛋白、肌酐和尿酸低于各自参考区间。尽管存在统计学显著差异，但急性300 mg/kg的发现未显示清晰、连贯的治疗相关血液学、肝脏、肾脏或代谢毒性模式。

3.3 28天重复经口给药毒性

化合物4b以15、30和60 mg/kg/天连续经口给药28天，未出现治疗相关死亡，雌雄动物均未观察到病理异常。所有实验组体重随时间增加，但给药组与对照组之间无显著差异。摄食和饮水消耗在治疗组与对照组之间无显著差异，表明化合物4b未影响摄食行为或水合状态。

3.4 血液学和生化参数

重复给药后，与溶媒对照相比，若干血液学参数存在统计学显著差异，但这些变化未呈现一致的剂量-反应模式，且雌雄小鼠均未见相应病理发现。MCV和MCH值在所有治疗组的雌雄小鼠中均低于参考区间；中性粒细胞百分比在所有治疗剂量下低于参考区间，而淋巴细胞百分比在雄性小鼠各剂量组及雌性小鼠15和30 mg/kg组高于参考区间；血小板计数在所有治疗组的雌雄小鼠中均高于参考区间。这些偏离未呈现跨性别的一致剂量依赖性模式。肾脏生化方面，血糖浓度在雌雄对照组和治疗组中均在参考区间内；尿素和尿酸值与参考区间相比无变化；肌酐值在雌雄对照组和治疗组中均低于参考区间，但肌酐和尿酸值与各自溶媒对照相比无显著差异且无一致剂量依赖性模式。肝脏生化方面，SGOT和SGPT值在雌雄各组的参考区间内一致，雄性值总体随剂量增加而降低；总胆红素在各组中均在参考区间内且与对照组无显著差异；ALP值在雌雄对照组和治疗组中均高于参考区间；总蛋白、白蛋白和球蛋白值在雌雄治疗组中均在参考区间内。脂质谱方面，HDL浓度在雌雄对照组和治疗组中均低于参考区间；总胆固醇在各组中相对参考区间无变化，但雄性小鼠在15和30 mg/kg时较雄性对照显著升高，在60 mg/kg时显著降低；LDL、甘油三酯和VLDL在雌雄各组中相对参考范围无重大变化。电解质方面，钠和钾浓度在雌雄各组中相对参考范围无变化；氯离子浓度在雌雄对照组和治疗组中均低于参考范围，碳酸氢盐浓度均高于参考范围。尽管多项电解质测量存在统计学显著差异，但未呈现跨性别的一致剂量依赖性模式，且未观察到伴随的电解质稳态紊乱的临床体征或其他发现。

3.5 组织病理学评价

大体尸检未发现给药化合物4b（15、30或60 mg/kg/天，28天）的动物所检器官存在明显治疗相关异常。组织病理学评价在溶媒对照组和高剂量组中进行，涵盖脑、肺、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、脾脏、胃、结肠和生殖器官。60 mg/kg/天高剂量组雌雄小鼠均未观察到治疗相关病变（雄性0/5，雌性0/5）。显微镜检查显示组织结构特征与对照组相当，未发现明显的治疗相关组织损伤、坏死、纤维化或不可逆病理变化。

四、讨论与结论

讨论部分指出，急性评估中高剂量水平观察到死亡，但300 mg/kg在14天观察期内无死亡，该剂量作为重复给药研究选择较低剂量的经验依据。重要的是，急性实验是参照OECD TG 425一般方法学原则进行的序贯剂量急性经口毒性/耐受性评估，并非完全符合该指南的上下法程序，因此不应将本研究结果解释为确定LD₅₀值。28天重复给药研究在所检终点中未显示一致的治疗相关毒理学模式。血液学和生化参数的统计学显著变化未在雌雄间呈现相似的剂量-反应关系，且无相应大体病理改变。个别参数偏离参考区间，但毒理学相关性需结合溶媒对照值、剂量-反应关系、性别差异、统计比较及各毒性终点间的一致性进行综合评价，而非仅依据参考区间单独判断。组织病理学发现为生化观察提供了补充背景信息，溶媒对照组和高剂量组所检器官均未发现治疗相关显微病变。然而，这些发现应限于组织病理学评估的范围，即仅限于选定器官以及溶媒对照组和高剂量组，且未记录绝对和相对器官重量。研究局限性包括未记录器官重量、组织病理学检查限于选定主要器官而非OECD TG 407推荐的完整组织面板、未对制剂浓度、均一性和稳定性进行分析验证。结论指出，合成化合物4b在本研究序贯剂量急性经口评估和28天重复给药研究的条件下，未显示死亡或明确的治疗相关毒性。15、30和60 mg/kg/天剂量下，在体重、血液学、生化、大体病理和所检组织病理学终点中未产生一致的治疗相关模式。这些发现为化合物4b提供了初步毒理学信息，但并未确立其整体安全性。急性评估未完全符合OECD TG 425程序，因此未确定LD₅₀值。未来仍需开展更长时程毒性研究、药代动力学表征、遗传毒性评估和药效学研究，以进一步阐明化合物4b的毒理学和药理学特征。