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•首次从食虫的海螺Conus tessulatus中分离出具有神经活性的mini-M型锥虫毒素。•ts3b和ts3c对背根节神经元有不同的影响。•ts3b在痛觉感受器中诱导不可逆的Ca2+兴奋，而ts3c则引起不可逆的阻断。•这两种肽都能导致鱼类麻痹，这表明它们可能在捕食策略中发
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首次从食虫的海螺Conus tessulatus中分离出具有神经活性的mini-M型锥虫毒素。
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ts3b和ts3c对背根节神经元有不同的影响。
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ts3b在痛觉感受器中诱导不可逆的Ca2+兴奋，而ts3c则引起不可逆的阻断。
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这两种肽都能导致鱼类麻痹，这表明它们可能在捕食策略中发挥作用。
引言
海洋锥蜗牛（属Conus）是目前已知最多样化的无脊椎动物群体，已描述了超过1000个物种，并且每年都有新物种被发现（Puillandre等人，2014年）。它们正逐渐成为基于肽的药物的重要来源（Gao等人，2017年；Vetter和J. Lewis，2012年）。据估计，每种锥蜗牛的毒液中含有100-200种生物活性肽（Olivera，2006年），这些肽经过超过5000万年的进化而形成（Duda和Palumbi，2004年），其主要目的是影响猎物的神经生理功能（如鱼类、其他软体动物和多毛类蠕虫）（Olivera等人，2014年）。迄今为止发现的锥虫毒素作用于神经靶点，因此具有潜在的治疗应用，例如镇痛剂、抗癫痫药物和调节心脏功能的药物，且副作用很小（Olivera，2006年；Zhang等人，2013年；Dib-Hajj等人，2007年；Norton，2010年；Bj?rn-Yoshimoto等人，2020年；Sudewi等人，2019年；Ramiro等人，2022年；Bj?rn-Yoshimoto等人，2025年）。
锥虫毒素前体的序列在N端具有高度保守的信号序列，在C端具有高度变异的成熟毒素区域，这些区域由大型基因超家族编码（Halai等人，2009年）。成熟毒素区域的高突变性使Conus物种能够产生分子多样性，从而靶向各种受体，包括电压门控离子通道、配体门控离子通道和G蛋白偶联受体（Olivera，1997年；Jakubowski等人，2005年；Duda和Lee，2009年）。此外，锥蜗牛的毒液由富硫肽和贫硫肽组成，这些肽根据半胱氨酸残基的数量进行分组。蜗牛利用这些成分协同作用来捕捉猎物或有效威慑捕食者（Lebbe和Tytgat，2016年）。富硫肽成分由于多个二硫键的存在而具有显著的结构稳定性，并具有靶向特异性，使其成为理想的三维分子支架，适用于药物设计（King，2011年）。
M超家族的锥虫毒素在结构和半胱氨酸连接性方面是最多样化的（McDougal等人，2008年；Jacob和McDougal，2010年）。M超家族中的富硫成员属于III型半胱氨酸框架（CC-C-C-CC），环状区域之间的氨基酸残基数各不相同（Robinson和Norton，2014年）。M超家族下的锥虫肽可以分为mini-M型（<22个氨基酸）和maxi-M型（>22个氨基酸）。至少有13种mini-M型锥虫毒素主要存在于Conus regius的毒液中，其生物学作用尚未被充分研究（Franco等人，2019年）。从Conus archon中发现的一种mini-M型锥虫毒素可以在45.7 μM的浓度下缓慢、可逆地抑制hα7 nAChRs（Hernández-Sámano等人，2022年）。尽管mini-M型锥虫毒素在锥蜗牛毒液中普遍存在且具有变异性，但对其药理作用了解仍然有限，它们可能成为新型生物活性肽的潜在来源或模型。
属于支系的物种（C. eburneus和C. tessulatus）通常被归类为食虫动物，但与食鱼和食软体动物的物种有密切的系统发育关系（Puillandre等人，2014年；Zhang等人，2019年）。Aman等人（2015年）对C. tessulatus的摄食策略进行了最全面的研究，发现它主要捕食多毛类蠕虫，也会 opportunistically捕食鱼类。在同一研究中，从C. tessulatus中纯化出了一种名为TSVIA的δ-锥虫毒素。迄今为止，已有超过50种C. tessulatus的锥虫毒素序列被存入UniProt和ConoServer等蛋白质数据库中。许多这些锥虫毒素序列是通过表达序列标签（EST）和cDNA克隆技术进行鉴定的，但没有进行肽的分离或明确的分子靶点验证（Zhou等人，2013年；Conticello等人，2001年）。最近对C. tessulatus毒液管的转录组分析表明，其锥虫肽序列与C. eburneus有有限的重叠，并且个体C. tessulatus的锥虫肽组成存在显著差异（Tablizo等人，2025年）。大约25%的锥虫肽序列在个体C. tessulatus中是唯一的，这表明环境变化和/或猎物偏好会影响C. tessulatus的毒液组成（Tablizo等人，2025年）。O2超家族在C. tessulatus中的多样性和表达程度最高，其次是O1、A和T超家族（Tablizo等人，2025年）。这些结果表明C. tessulatus的锥虫肽具有丰富的化学多样性。
本研究报道了从食虫海螺C. tessulatus的毒液中纯化、鉴定和神经活性筛选两种mini-M型锥虫毒素ts3b和ts3c，以及两种额外的ts3b类似物（ts3b Asn15和ts3b Ser7Arg, Asn15）。通过电喷雾离子化串联质谱（ESI-MS/MS）碎片化结合转录组序列匹配以及互补的Edman降解分析来鉴定初级序列。原始锥虫毒素ts3b和t3c的活性通过鱼类涡流试验、小鼠颅内生物试验（ICMBA）、背根节（DRG）试验和星座药理学试验进行了评估。
章节片段
蜗牛采集、解剖和分子鉴定
2016年3月和4月以及2019年11月， researchers使用缠网在菲律宾宿务省Lapu-Lapu市的Caw-oy和Sogod采集了C. tessulatus样本（BFAR免费许可编号：0128-17）。共采集到29只锥蜗牛，每种根据壳形和形态进行鉴定。根据Lavergne等人的方法（2013年），将三个毒液管保存在RNAlater?中进行转录组分析。还进行了COI鉴定以验证物种身份。采集的样本包括
ts3b、ts3c及其类似物的纯化和行为试验
讨论
本研究报道了C. tessulatus粗毒液成分的生物活性，并纯化了mini-M型锥虫毒素ts3b和ts3c，以及ts3b类似物ts3b Asn15和ts3b Ser7Arg Asn15。通过Edman测序、MS/MS碎片化和转录组分析的整合使用，这些锥虫毒素的序列得到了高度可靠的鉴定。到目前为止，已经从多种食虫和食软体动物的Conus物种中分离出了mini-M型锥虫毒素
结论
从食虫海螺Conus tessulatus中纯化了mini-M型锥虫毒素ts3b、ts3c及其两种异构体。尽管ts3b和ts3c具有相同的III型半胱氨酸结构，但它们表现出不同的神经药理特性。这些mini-锥虫毒素能够诱导鱼类麻痹，这表明C. tessulatus拥有多种针对脊椎动物的化学武器。此外，ts3b类似物的存在突显了M2分支的进化多样性
CRediT作者贡献声明
Lilibeth Salvador-Reyes：写作——审稿与编辑，撰写原始草稿，验证，监督，资源获取，项目管理，方法论，资金获取，概念化。Charmaine B. Mendoza：写作——审稿与编辑，撰写原始草稿，可视化，研究，数据分析，概念化。Zildjian G. Acyatan：写作——审稿与编辑，撰写原始草稿，可视化，验证，研究，数据分析，
未引用的参考文献
Halai和Craik，2009年；Jones等人，2009年；Olivera等人，2006年。
伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。该研究获得了菲律宾迪利曼大学动物护理和使用委员会的批准。
主要贡献
本研究首次报道了从捕虫海螺Conus tessulatus中纯化、鉴定并 analysis 了两种mini-M型锥虫毒素及其类似物。
? 作者声明该研究未曾发表过，也没有在其他地方接受审查，并且所有作者都对研究做出了重要贡献
本研究由UP新兴跨学科研究（EIDR）计划（OVPAA-EIDR-06-007，Conus结构外显基因组学计划）和科学技术部——菲律宾健康研究与发展委员会资助（FP（140015）
? 作者声明他们没有任何已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
作者感谢Noel Saguil博士、Jose Arbasto和Meljune Chicote在样本采集和解剖方面的协助，感谢Corazon Ericka Mae Itang（UP Diliman大学化学研究所）在ESI-MS中的实验操作，以及Helena Safavi-Hemami博士（犹他大学）分享C. tessulatus的注释转录组数据。本工作是在渔业和水资源局的监督下进行的，获得了DA-BFAR发布的免费许可
Charmaine B. Mendoza|Zildjian G. Acyatan|Ella Mae E. Gamba|Baldomero M. Olivera|Eizadora T. Yu|Gisela P. Concepcion|Arturo O. Lluisma|Lilibeth Salvador-Reyes
