《EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY》：Integrated computational metabolomics and cheminformatic profiling of Pseudomonas aeruginosa LasR modulators from hybrid sunflower seed metabolites
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杂交向日葵（Helianthus annuus）种子及其代谢组相较于非杂交变种尚未得到充分探索，其可能在发现新型群体感应（QS）调控剂方面具有潜在健康益处。因此，本研究利用计算代谢组学对六个杂交H. annuus品种进行代谢谱分析，并采用化学信息学方法将代谢物
杂交向日葵（Helianthus annuus）种子及其代谢组相较于非杂交变种尚未得到充分探索，其可能在发现新型群体感应（QS）调控剂方面具有潜在健康益处。因此，本研究利用计算代谢组学对六个杂交H. annuus品种进行代谢谱分析，并采用化学信息学方法将代谢物与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的关键传感蛋白LasR进行建模。化学计量学建模显示品种相关的代谢物谱[先正达（SY）、Pannar和P65品种中含有较多的绿原酸和calceolariosides]。研究发现共注释了60种代谢物，其中12,13-二羟基-9-十八碳烯酸（12,13-DiHOME）、黄苷、calceolarioside A和B、法尼醇和可替宁为首次在葵花籽中报道。三种先导代谢物（calceolarioside B、迷迭香酸和绿原酸）在LasR活性位点经100纳秒（ns）模拟后，与关键残基（Tyr88、Phe96、Thr110和Ser124）形成了热力学稳定的相互作用。先导配体-LasR复合物还显示出显著的疏水和氢键相互作用。所有先导化合物均表现出比自诱导剂（–41.12千卡/摩尔，kcal/mol）和参考标准品肉桂醛（–16.30 kcal/mol）更低的结合自由能（?Gbind），范围从–53.46 kcal/mol（calceolarioside B）到–45.51 kcal/mol（迷迭香酸）。药代动力学预测表明，这些先导化合物在利平斯基五规则（Lipinski's rule of 5）范围内外均具有可开发性。量子反应性属性支持了对排名前两位的代谢物——calceolarioside B和迷迭香酸的优选筛选。本研究首次生成了六个H. annuus杂交种子品种的全面代谢组图谱/丰富度（萜类、酚酸、生物碱、氨基酸），从而证实了这些种子变种的农业开发价值。所识别的先导代谢物在经过额外的体内（in vivo）和体外（in vitro）验证步骤后，有望作为新型LasR调控剂进行开发。
一、研究背景与研究意义
抗生素耐药性（AMR）已成为全球性的公共卫生危机，每年导致超过70万人死亡，预计到2050年这一数字将攀升至约1000万。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种典型的耐药病原体，占医院感染的26%，其对碳青霉烯类等最后防线抗生素的耐药率在南非高达33%。该细菌主要通过群体感应（QS）系统调控毒力因子的表达，如生物膜形成、绿脓菌素和胞外多糖分泌。其中，Las系统是铜绿假单胞菌的核心QS系统，LasR蛋白在与自诱导剂N-（3-氧代十二烷酰基）-L-高丝氨酸内酯（3-oxo-C12-HSL）结合后，激活一系列与毒力和生物膜形成相关的基因转录。因此，选择性抑制Las系统被认为是阻断毒力信号级联反应、降低细菌致病性和耐药性的可行策略。
天然产物尤其是植物源代谢物，因其结构多样性和低毒性，成为寻找新型QS抑制剂的重要来源。向日葵（Helianthus annuus）种子虽广泛用于食用油提取和食品加工，但其杂交品种的代谢组学和治疗潜力，特别是针对QS系统的调控作用，尚未被系统研究。基于此，研究人员提出利用计算代谢组学和化学信息学策略，首次对六种杂交向日葵种子品种的代谢物进行全面鉴定，并通过分子对接、分子动力学（MD）模拟等方法，筛选能够有效调控铜绿假单胞菌LasR蛋白的先导化合物。
二、关键技术方法概述
研究人员采用了以下主要技术方法：
- 1.
液相色谱-质谱联用（LC-MS）数据采集与处理：对六种杂交向日葵种子品种（包括Pannar、Agsun、Aguara、Limagrain (LG)、Syngenta (SY)和P65）的甲醇提取物进行超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）分析，获取代谢物谱数据。
- 2.
特征分子网络（FBMN）分析与代谢物注释：利用全球天然产物社会分子网络平台（GNPS）进行特征分子网络分析，并结合手动验证和数据库比对，对检测到的代谢物进行推定注释。
- 3.
分子对接：将注释得到的60种代谢物与铜绿假单胞菌LasR蛋白（PDB ID: 3jpu）进行分子对接，筛选出结合亲和力最高的先导化合物。
- 4.
分子动力学（MD）模拟：对排名前三的先导化合物-LasR复合物进行100 ns的分子动力学模拟，评估其结合稳定性、构象变化和能量特征。
- 5.
药代动力学预测：使用SwissADME工具预测先导化合物的口服药物相似性。
- 6.
密度泛函理论（DFT）计算：对排名前二的先导化合物进行量子化学性质计算，以进一步验证其反应活性。
三、主要研究结果
1. 杂交向日葵种子代谢谱分析
通过无监督主成分分析（PCA）揭示了不同品种间代谢物的差异分布。基于特征分子网络的代谢物注释共鉴定了60种代谢物，涵盖酚酸、脂质、萜类、生物碱和氨基酸等多种类别。其中，12,13-二羟基-9-十八碳烯酸（12,13-DiHOME）、黄苷、calceolarioside A和B、法尼醇和可替宁为首次在葵花籽中报道。化学计量学分析显示，先正达（SY）、Pannar和P65品种含有更多的绿原酸和calceolariosides。
2. 分子对接结果
在所有60种代谢物中，calceolarioside B（–11.1千卡/摩尔，kcal/mol）、迷迭香酸（–10.3 kcal/mol）和绿原酸（–10.1 kcal/mol）表现出最低的对接分数，即对LasR蛋白的最高亲和力，显著优于自诱导剂3-oxo-C12-HSL（–8.0 kcal/mol）和阳性对照肉桂醛（–6.9 kcal/mol）。这三种先导化合物均为羟基肉桂酸亚类衍生物，其结合主要依赖于氢键、π键、烷基和范德华力等相互作用，并与关键残基Trp88、Phe101、Trp60、Tyr56和Ala105发生作用。
3. 分子动力学模拟与热力学分析
经过100 ns的MD模拟，结合自由能（?Gbind）计算结果表明，LasR+calceolarioside B复合物的结合自由能最低（–53.46 kcal/mol），其次是LasR+迷迭香酸（–49.90 kcal/mol）和LasR+绿原酸（–45.51 kcal/mol），均远低于自诱导剂（–41.12 kcal/mol）和肉桂醛（–16.30 kcal/mol）。
在结构稳定性方面，所有先导化合物-LasR复合物的平均均方根偏差（RMSD）均小于3 ?，并在30 ns后趋于平衡，表明系统稳定。均方根波动（RMSF）分析显示，各系统平均原子波动均在3 ?以内，表明结合未引起LasR活性位点残基的显著柔性变化。回转半径（RoG）分析表明，先导化合物结合后的复合物回转半径（15.33–15.39 ?）略低于或接近未结合蛋白（15.35 ?），显示出良好的紧凑性和稳定性。溶剂可及表面积（SASA）分析也支持上述结论，先导化合物结合后未引起蛋白表面面积的显著扩张。此外，分子内氢键（IH-bonds）数量分析显示，先导化合物结合后维持或增强了氢键网络，其中LasR+迷迭香酸体系平均氢键数最高（82个），有助于增强结合稳定性。
4. 接触图谱分析
接触图谱直观展示了在模拟过程中，先导化合物与LasR关键残基（如Tyr88、Phe96、Thr110、Ser124）之间的高频相互作用，进一步证实了其在活性位点的稳定结合模式。
5. 药代动力学预测
药代动力学预测结果显示，三种先导化合物在利平斯基五规则（Lipinski's rule of 5）范围内外均具有良好的药物相似性和口服开发潜力。
6. 密度泛函理论计算
通过密度泛函理论（DFT）计算，分析了排名前二的先导化合物（calceolarioside B和迷迭香酸）的前线分子轨道能级（HOMO/LUMO）及相关量子化学描述符，其较低的能隙值表明它们具有较强的化学反应活性和与靶蛋白相互作用的潜力，进一步支持了其作为先导化合物的优选地位。
四、总结与结论
本研究首次系统描绘了六种杂交向日葵（H. annuus）种子品种的全面代谢组图谱，鉴定了60种推定代谢物，并从中筛选出三种具有强效LasR调控潜力的先导化合物：calceolarioside B、迷迭香酸和绿原酸。通过分子对接、100 ns分子动力学模拟、结合自由能计算、药代动力学预测及密度泛函理论分析，综合验证了这三种代谢物能与LasR活性位点形成稳定、紧凑的结合，并展现出优于天然自诱导剂的结合亲和力。研究结论指出，这些来自杂交向日葵种子的先导代谢物在经过进一步的体内（in vivo）和体外（in vitro）验证后，有望开发为新型的铜绿假单胞菌LasR调控剂，为应对日益严峻的抗生素耐药性问题提供新的候选分子。
