新型香豆素基吡啶与吡喃杂合体：合成、抗菌活性及in silico ADMET成药性评价

《Scientific Reports》：Antimicrobial activity and ADMET analysis of novel coumarin-based pyridine and pyran hybrids

　　

一系列新型含吡啶和吡喃的色烯（chromene）母核化合物已以6-(2-(4-硝基苯基)二氮烯基)-3-乙酰基-2H-色烯-2-酮 1为起始原料合成。新合成衍生物的化学结构通过不同光谱技术（FT-IR、¹HNMR和¹³CNMR）及元素分析进行了表征。所有衍生物均采用肉汤微量稀释（broth microdilution）和琼脂孔扩散（agar well-diffusion）技术，对其针对六株临床分离的多重耐药（multidrug resistance, MDR）菌株的体外抗菌活性进行了评估，包括革兰阳性菌（Bacillus pumilis、Streptococcus faecalis）和革兰阴性菌（Escherichia coli、Enterobacter cloacae）以及真菌（Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans）。合成化合物对受试菌株表现出中等至良好的抗菌活性，其中若干衍生物的效力接近参考药物，且有一个实例与参考药物相当。值得注意的是，2a、5a、5b、6b、7b和8a衍生物成为最有前景的杀菌和杀真菌剂。化合物5a对S. faecalis表现出优异活性，与Penicillin G相当，最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）值为（3.91 μg/ml），最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）值为（31.3 μg/ml）。此外，化合物5b、6b、7b和8a对S. faecalis显示出优异效力，MIC值为（7.81 μg/ml），杀菌活性MBC值为15.6至62.5 μg/ml。此外，化合物6a、6b、8a和8b的计算机模拟（in-silico）ADMET（absorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity）分析表明其符合Pfizer指南，反映出良好的理化性质。

结果与讨论（Results and discussion）显示，研究人员围绕香豆素基吡啶和吡喃杂合体开展了合成、抗菌评价及ADMET预测。抗菌药物耐药（antimicrobial resistance, AMR）使细菌、病毒、真菌、寄生虫等可在药物存在下适应并繁殖；Vancomycin-resistant Enterococci（VRE）、Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）和MDR革兰阴性菌导致许多药物失效，侵袭性真菌感染亦带来挑战。抗生素滥用促进MDR微生物增殖并增加发病和死亡。现有抗菌药按作用机制可分为去极化细胞膜、抑制蛋白合成、抑制核酸合成和抑制代谢过程等类别。由于抗生素治疗细菌感染的前景不确定，需要发现与已知抗菌药类别作用不同的新型抗菌化合物，并降低现有药物毒性和副作用。香豆素（coumarins）是广泛分布于植物的杂环，具有抗菌、抗癌、抗病毒、抗炎等活性；吡啶（pyridine）和吡喃（pyran）也是重要杂环骨架，具有抗菌等药理活性。研究人员据此设计并合成新型香豆素基吡啶和吡喃衍生物，评价其抗菌潜力并进行in silico ADMET预测。研究以6-(2-(4-硝基苯基)二氮烯基)-3-乙酰基-2H-色烯-2-酮 1为起始原料，合成一系列含色烯母核的吡啶和吡喃杂合体，用FT-IR、¹HNMR、¹³CNMR和元素分析表征。所有衍生物针对六株受试菌株进行体外抗菌筛选，包括革兰阳性菌Bacillus pumilis、Streptococcus faecalis，革兰阴性菌Escherichia coli、Enterobacter cloacae，以及真菌Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans，采用肉汤微量稀释和琼脂孔扩散法，并测定MIC、MBC、最低杀真菌浓度（minimum fungicidal concentration, MFC）。对6a、6b、8a、8b进行in silico ADMET分析。结论显示若干衍生物具有中等到良好抗菌活性，5a对S. faecalis与Penicillin G相当；但ADMET提示水溶性差、不符合Lipinski五规则、毒性风险高，需结构优化和实验验证。

关键技术方法方面，研究人员以化合物1为起始，与4-甲氧基苯甲醛或p-N,N-二甲基氨基苯甲醛在乙醇/哌啶中回流制得α,β-不饱和酮2a,b；分别与丙二腈/醋酸铵、丙二腈/哌啶、氰乙酸乙酯/醋酸铵、氰乙酸乙酯/哌啶、水合肼等反应构建吡啶、吡喃和吡唑环。结构表征采用熔点、TLC、FT-IR、¹HNMR、¹³CNMR和元素分析。抗菌评价使用受试菌株：Bacillus pumilis MTCC-2296、Streptococcus faecalis MTCC-0459、Escherichia coli ATCC-25955、Enterobacter cloacae ATCC-23355、Saccharomyces cerevisiae ATCC-9763、Candida albicans ATCC-10231。按Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）指南采用琼脂孔扩散、纸片扩散和肉汤稀释法测定抑菌圈（inhibition zone, IZ）、MIC、MBC、MFC；ADMET通过计算机预测。

研究结果如下。化学（Chemistry）：研究人员通过合成路线由化合物1与醛缩合得到查尔酮2a,b；2a或2b与丙二腈/醋酸铵生成2-氨基烟腈5a,b，与丙二腈/哌啶生成4H-吡喃-3-甲腈6a,b，与氰乙酸乙酯/醋酸铵生成2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲腈7a,b，与氰乙酸乙酯/哌啶生成2-氧代-2H-吡喃-3-甲腈8a,b；2a与水合肼环化得吡唑9。FT-IR、¹HNMR、¹³CNMR和元素分析支持结构，部分化合物通过替代路线验证。生物活性（Biological activity）—抗菌筛选（Antimicrobial screening）：采用纸片扩散和肉汤稀释法测定IZ、MIC、MBC、MFC。5a和5b对B. pumilis的IZ为20和22 mm，接近Penicillin G的25 mm；5b、7a、9对S. faecalis的IZ为20和21 mm，略高于Penicillin G的19 mm；2a、6b、8a对E. coli和E. cloacae的IZ为20–22 mm，低于Ciprofloxacin的30和27 mm；6b对E. cloacae IZ为22 mm；6b和7a对S. cerevisiae IZ为20和21 mm，与ketoconazole的21 mm相当；6b对C. albicans IZ为22 mm，约等于ketoconazole。MIC和MBC：与Penicillin G（MIC 0.125–3.91 μg/mL，MBC 0.5–15.6 μg/mL）和Ciprofloxacin（MIC 0.16–0.250 μg/mL，MBC 0.5–1 μg/mL）相比，合成化合物MIC为1.95–62.5 μg/mL，MBC为15.6–125 μg/mL或250 μg/mL。5a对S. faecalis MIC 3.91 μg/mL、MBC 31.3 μg/mL，接近Penicillin G；5b、6b、7b、8a对S. faecalis MIC 7.81 μg/mL，MBC 15.6–62.5 μg/mL。2a、5b、6a、9对B. pumilis MIC 7.8 μg/mL、MBC 31.3 μg/mL；7a活性最低，MIC 62.5 μg/mL、MBC 125 μg/mL。5a、5b、6b、7b对E. coli MIC 1.95 μg/mL、MBC 15.6或31.3 μg/mL；6b和8a对E. cloacae MIC 3.91 μg/mL、MBC 31.3 μg/mL；6a和7b对E. cloacae最弱，MIC 62.5 μg/mL、MBC 125或250 μg/mL。MIC和MFC：对S. cerevisiae，除7a和7b的MIC为15.6 μg/mL外，其余化合物MIC较合理；对C. albicans，5b、6b、8a的MIC为15.6 μg/mL。对两种真菌，所有化合物MFC中等，除6a、7a、7b的MFC为62.5 μg/mL。构效关系（structure-activity relationship, SAR）研究：偶氮基(N=N-)增强生物活性并作为药效团，可抑制细菌并促进微生物膜破坏。2a因α,β-不饱和酮对S. faecalis活性提高。5a因吡啶氮孤对电子、NH₂和供电子OCH₃对S. faecalis显著。5b因N,N-二甲基氨基、NH₂和两个甲基对B. pumilis和S. faecalis略优于Penicillin G。6a因吡喃、吸电子CN和NO₂仅中等；6b因NH₂和两个甲基对所选真菌更活跃。7a因吡啶氮孤对电子和OCH₃对S. faecalis、E. coli和E. cloacae较好。5a、5b、6b、7b对E. coli MIC 1.9 μg/mL，但低于Ciprofloxacin。8a,b因吡喃和CN中等。2a环化为吡唑9改善抗菌活性，尤其对S. faecalis。总体供电子基优于吸电子基：N,N-二乙氨基>OCH₃；吡啶衍生物活性高于吡喃衍生物，如7b>8b。真菌方面多数中等，5b、6b、8a对C. albicans较高。合成化合物的计算机模拟药代动力学ADMET预测：对6a、6b、8a、8b预测，重原子数11、可旋转键相同、立体中心1、环数5；分子量约521–594 g/mol，高于Lipinski五规则500 g/mol，故该规则Rejected；6a和6b有2个氢键供体，8a和8b无；拓扑极性表面积（topological polar surface area, TPSA）为168.34–151.40 ?²；LogP 8系列为3.58/3.39，6系列为2.67/2.62；LogS为?5.16至?6.92，水溶性差；人肠道吸收（human intestinal absorption, HIA）为0.00，不能穿过血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）；口服生物利用度F为20%和30%，概率0.50–0.85；Caco-2和MDCK约?5.0；血浆蛋白结合（plasma protein binding, PPB）为97.5–98.7%，未结合分数（fraction unbound, Fu）为0.9–2.7%；CYP1A2抑制概率高，CYP2C19和CYP2D6抑制可忽略，可能为CYP2C9和CYP3A4底物，尤其8a；表观分布容积（volume of distribution, VDss）约0.1 L/kg；药物性肝损伤（drug-induced liver injury, DILI）为1.00；hERG为0.04–0.08；Ames为0.99–1.00；致癌性为0.99–1.00；皮肤致敏为0.87–0.97；呼吸毒性；水生毒性。虽然对多个微生物靶点显示良好in-silico结合亲和力，但ADMET缺陷显著。

讨论与局限性（Limitations of the study）总结：研究结果为初步发现，抗菌和抗真菌谱仅限六株受试菌株，使用单次测试，仍需重复性统计评估；未测哺乳动物细胞毒性、血液相容性和治疗选择性指数（selectivity index, SI）；ADMET数据仅基于计算机预测，未经实验验证；提出的SAR基于少量化合物，作用机制未实验验证。

结论（Conclusion）翻译：总之，研究人员成功合成新型香豆素衍生物2a、5a,b、6a,b、7a,b、8a,b和9，并体外评价其针对一组病原细菌和真菌的抗菌效力。结果显示，化合物5a、5b、6b、7b和8a对受试菌株表现出有前景的广谱抗菌活性。化合物5a对S. faecalis表现出优异活性，接近Penicillin G，MIC值为3.91 μg/ml，MBC值为31.3 μg/ml。此外，化合物5b、6b、7b和8a对S. faecalis显示出优异效力，MIC值为7.81 μg/ml，杀菌活性MBC值为15.6至62.5 μg/ml。in silico ADMET分析为化合物6a、6b、8a和8b的药代动力学和毒性特征提供了初步信息，但也显示水溶性差、不符合Lipinski五规则以及高毒性风险。因此，在考虑这些化合物进入临床前开发之前，需要进一步结构优化和实验验证。