墨西哥牛至（Lippia graveolens）浸液与香芹酚（Cv）调控乳腺癌细胞系细胞因子浓度、诱导凋亡并调节抗氧化酶表达及功能：基于生物活性分子治疗的意义

《Antioxidants》：Mexican Oregano Infusion and Carvacrol Modify Cytokine Concentration, Induce Apoptosis, and Regulate Antioxidant Enzyme Expression and Function in Breast Cancer Cell Lines: Implications for Bioactive Molecule-Based Therapeutics

背景/目的：乳腺癌（BC），尤其是三阴性（TNBC）等侵袭性亚型，因治疗耐药和治疗毒性仍是重大临床挑战。本研究评估了墨西哥牛至（Lippia graveolens）浸液（MoI）及其生物活性成分香芹酚（Cv）在多种BC细胞系（MCF-7、HCC-1954和MDA-MB-231）中的抗肿瘤潜力、抗氧化活性和抗炎作用。方法：通过量化凋亡、分析细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）谱以及分析抗氧化酶（CAT、SOD2、GPX1）基因表达及其酶活性，评估细胞反应。结果：Cv表现出强效、亚型非依赖的促凋亡活性，而MoI表现出显著疗效且在非肿瘤HaCaT细胞中细胞毒性减弱。两种处理均介导细胞因子信号的复杂修饰，其特征是肿瘤促进性IL-4、IL-6和IL-10细胞外浓度降低，该效应在高度侵袭性MDA-MB-231细胞系中最明显。转录和功能分析进一步显示，这些药物改变抗氧化酶的表达和活性，从而促进有利于癌细胞死亡的促氧化环境。结论：这些发现表明，MoI和Cv通过凋亡诱导、细胞外细胞因子水平调节和氧化还原紊乱的协同途径发挥抗肿瘤作用。因此，MoI因其对炎症网络和氧化还原脆弱性的影响，成为BC管理尤其是侵袭性亚型辅助治疗策略的有希望候选物。同时，Cv可作为靶向肿瘤学研究的有吸引力先导化合物。

乳腺癌（breast cancer, BC）是全球女性癌症相关发病和死亡的主要原因之一，传统手术、放疗、化疗、内分泌治疗和靶向治疗仍面临耐药、副作用以及三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）等侵袭性亚型预后差的问题。TNBC缺乏有效治疗靶点，主要依赖化疗，因此需要开发新策略。植物来源提取物和化合物受到关注。墨西哥牛至（Lippia graveolens Kunth）在传统医学中用于抗菌、抗炎和抗氧化，香芹酚（carvacrol, Cv）是其高含量单萜酚，可在包括BC的多种癌细胞系中发挥细胞毒和促凋亡作用，涉及抑制Bcl-2、改变线粒体膜电位、促进细胞色素C释放、调节酪氨酸激酶受体（TKR）信号、部分抑制TRPM7阳离子通道以及影响PI3K/AKT、MAPK、JAK/STAT等通路，并通过增加活性氧（reactive oxygen species, ROS）诱导氧化应激。然而，墨西哥牛至浸液（Mexican oregano infusion, MoI）机制未知，Cv对肿瘤微环境中关键细胞因子及ROS升高的机制信息仍不足。因此，研究人员评估MoI或Cv处理如何改变不同分子亚型BC细胞系（MCF-7、HCC-1954和MDA-MB-231）的氧化还原平衡、细胞因子分泌及其与凋亡的关系。

研究人员开展的研究显示，MoI和Cv通过相互关联的机制发挥抗肿瘤作用，包括氧化还原失衡、炎症信号修饰以及凋亡通路激活，但幅度和分子特征因BC亚型而异。Cv具有强效、亚型非依赖的促凋亡活性，但在非肿瘤HaCaT细胞中也产生明显毒性；MoI促凋亡作用较温和，可能因复杂植物化学组成而具有更有利的治疗特征。两种处理可降低肿瘤促进性白细胞介素（interleukin, IL）-4、IL-6和IL-10的细胞外浓度，尤其在MDA-MB-231中显著。抗氧化防御方面，MoI和Cv改变过氧化氢酶（catalase, CAT）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2, SOD2）和谷胱甘肽过氧化物酶1（glutathione peroxidase 1, GPX1）表达及部分酶活性，促进促氧化环境。该研究提示MoI可作为BC，特别是侵袭性亚型的辅助治疗候选，Cv可作为靶向肿瘤学先导化合物。

关键技术方法概括：细胞系MCF-7、HCC-1954、MDA-MB-231和HaCaT购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。植物材料来自墨西哥哈利斯科州Totatiche，凭证标本No. SIST-TRA-20250506存放于瓜达拉哈拉大学植物研究所（IBUG）。采用水提法获得MoI，并使用先前报道的半数抑制浓度（IC₅₀）和处理时间。凋亡通过Cell Death Detection ELISA检测胞质组蛋白相关DNA片段；细胞因子IL-4、IL-6、IL-10通过夹心ELISA定量；RNA经TRIzol提取，RT-qPCR使用TaqMan探针，以POLR2A为参考基因，按2^?ΔΔCt法计算相对表达。GPX、CAT和SOD2活性采用商业试剂盒测定；统计分析使用R，采用ANOVA、Dunnett后验检验和Pearson相关。

结果部分，3.1 凋亡诱导：研究人员比较MoI、Cv和依托泊苷对四株细胞凋亡的影响。MoI在HaCaT中仅轻度增加凋亡（1.21倍），在BC细胞系中增加1.32–1.40倍；Cv在HaCaT中增加近4倍，在BC细胞系中增加3.5–3.8倍；依托泊苷诱导5.3–6.1倍。Cv促凋亡效果在三种BC亚型中一致，包括MDA-MB-231。3.2 细胞因子产生：IL-4基础水平及调控因细胞系而异。MoI降低HaCaT和HCC-1954的IL-4，Cv升高HaCaT的IL-4并在HCC-1954中维持接近基线；MCF-7中两种处理中度升高IL-4；MDA-MB-231中Cv将IL-4降至约基础水平20%。IL-6变化高度依赖细胞类型，HCC-1954中Cv使IL-6增近4倍；MDA-MB-231基础IL-6极高，MoI处理后超过检测上限（>500 pg/mL），Cv和依托泊苷显著降低但仍高于其他模型。IL-10在HaCaT中MoI升高，在MCF-7和HCC-1954中变化不大；MDA-MB-231基础IL-10最高，MoI和Cv均降低其分泌，MoI最强。3.3 RT-qPCR参考基因验证：CAT、SOD2、GPX1标准曲线扩增效率分别为1.94、1.87、1.99，R²均为1.00；POLR2A扩增特征最接近目标基因，ACTB和GAPDH偏差较大，故POLR2A被选为最适参考基因。3.4 抗氧化酶基因表达：MoI和Cv以细胞系依赖方式调节CAT、GPX1和SOD2。HaCaT中MoI降低CAT 44.5%、GPX1 56.0%，升高SOD2 61.9%；Cv升高SOD2 35.2%，轻度降低CAT 14.4%，轻度升高GPX1 16.1%。MCF-7中两种处理降低CAT 59.9%和52.2%；MoI升高GPX1 26.6%，Cv升高SOD2 241.1%并降低GPX1 55.9%。HCC-1954中MoI升高CAT 20.6%、SOD2 45.4%，降低GPX1 43.0%；Cv降低CAT 32.9%、SOD2 24.8%、GPX1 72.2%。MDA-MB-231中MoI降低CAT 57.8%、SOD2 76.2%、GPX1 38.0%；Cv分别降低17.6%、28.8%、17.6%。3.5 抗氧化酶活性：GPX活性部分反映转录变化。HaCaT中MoI和Cv分别升高GPX活性14.44%和33.19%；MCF-7中Cv降低72.03%，MoI中度升高；HCC-1954中MoI升高82.7%，Cv降低11.5%；MDA-MB-231中MoI降低18.64%，Cv轻度升高2.97%。CAT活性在所有细胞系和处理中稳定在0.13–0.14 nmol/min/mL，与转录变化不一致。SOD2活性变化中等：HaCaT中MoI和Cv小幅显著降低；MCF-7基本不变；HCC-1954中MoI升高18.80%，与转录上调一致，Cv无显著影响；MDA-MB-231中MoI略降，Cv无显著影响。3.6 相关性热图与层次聚类：使用ClustVis、行中心化和单位方差缩放，以Pearson相关距离和平均连锁聚类。MDA-MB-231中Cv处理形成独立分支，表现为较低IL-6和较高SOD2、GPX1酶活性；HaCaT和HCC-1954中MoI形成独特簇，表现为较低IL-4、较高SOD2和GPX1酶活性及中度升高IL-10；MCF-7中Cv和MoI均表现为较高IL-4和较低GPX1酶活性。所有模型中抗氧化酶mRNA水平保持低值或接近基线。

讨论部分总结：既往研究已报道Cv和牛至提取物的抗癌活性，本研究进一步显示MoI和Cv通过氧化还原失衡、炎症信号改变和凋亡激活发挥抗肿瘤作用，但不同BC亚型分子特征不同。Cv促凋亡强且跨亚型，但在非肿瘤HaCaT中也有明显毒性；MoI凋亡作用较温和，提示其复杂植物化学组成可能带来互补活性并降低非肿瘤毒性。IL-4降低可减弱肿瘤支持信号；IL-6降低可能抑制增殖、上皮–间质转化、侵袭和耐药；IL-10降低可能削弱免疫抑制并增加凋亡易感性。Cv并非统一抑制炎症因子，部分模型中可升高IL-6或IL-10，提示复杂适应性应激反应。MDA-MB-231对Cv介导的促肿瘤细胞因子网络破坏尤为敏感。抗氧化方面，MDA-MB-231中两种处理协调性降低CAT、GPX1和SOD2，提示抗氧化防御受损并增加氧化损伤易感性。Nanni等关于Origanum vulgare乙醇提取物的研究支持牛至提取物可通过升高ROS降低黑色素瘤B16-F10细胞活力，且对非肿瘤C2C12肌成纤维细胞毒性较低。MCF-7中Cv诱导SOD2过表达并下调GPX1，可能促进H₂O₂积累；HCC-1954中Cv广泛抑制抗氧化防御。酶活性与转录不完全一致，CAT稳定，SOD2变化中等，GPX1最敏感。研究局限包括HaCaT并非正常乳腺上皮来源，未来需用MCF-10A等；细胞因子未按总蛋白或活细胞数标准化，降低可能继发于活力下降；MDA-MB-231中IL-6超过检测上限（>500 pg/mL）。总体而言，MoI和Cv对抗氧化防御的转录和功能影响协调但仅部分重叠，支持进一步研究牛至来源植物化学物作为靶向氧化还原脆弱性的辅助策略，尤其用于侵袭性BC亚型。

研究结论翻译：MoI和Cv是BC有前景的替代治疗候选物。值得注意的是，MoI导致关键细胞因子（IL-4、IL-6和IL-10）的细胞外浓度改变；然而，这些调节效应具有细胞系依赖性，反映所测试BC模型的表型异质性。这种降低表明，它可能干扰对癌症进展和治疗耐药至关重要的生物过程，如血管生成、增殖和免疫逃逸。在各自实验条件下，MoI和Cv表现出不同的体外特征。具体而言，MoI处理的特征是上述细胞因子细胞外水平和酶促抗氧化防御机制降低。此外，在非肿瘤HaCaT细胞模型中，MoI在评估浓度下表现出特异性细胞毒性谱，突出其独特生物活性。相反，Cv表现出不同的抗癌特性，尤其导致这些细胞因子细胞外浓度增加，这一反应在肿瘤微环境中具有潜在情境依赖性意义。复杂天然提取物和分离植物化学物均具有独特活性，值得在TNBC等预后不良癌症中进一步探索。然而，要建立关于其相对效力、安全性或选择性的明确主张，需要全面的等效浓度–反应测定。需要进一步研究以充分阐明其作用机制、在肿瘤微环境中的相互作用以及补充常规治疗的潜力。