《Marine Drugs》：Biocompatibility and Wound-Healing Performance of an Amberjack (Seriola quinqueradiata) Skin-Derived Acellular Dermal Matrix in a Porcine Full-Thickness Wound Model
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尽管鱼皮源脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix, ADM）正成为一类新兴的非哺乳动物创面基质，但除鳕鱼和罗非鱼之外的物种仍研究不足。本研究从日本琥珀鱼（Seriola quinqueradiata）皮中制备了ADM，并与商业鳕鱼皮源基
尽管鱼皮源脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix, ADM）正成为一类新兴的非哺乳动物创面基质，但除鳕鱼和罗非鱼之外的物种仍研究不足。本研究从日本琥珀鱼（Seriola quinqueradiata）皮中制备了ADM，并与商业鳕鱼皮源基质（Kerecis Omega3 Wound）及未处理创面比较，评价其理化性质、生物相容性和创面愈合性能。琥珀鱼皮源ADM（amberjack skin-derived ADM, AFS）通过脱细胞、脱色和冷冻干燥制备，并采用残留双链DNA（double-stranded DNA, dsDNA）含量、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）组成、微结构、溶胀行为、拉伸性能、细胞相容性（ISO 10993-5）、大鼠皮下植入（ISO 10993-6）以及42天猪全层创面模型进行表征。AFS显示出高效脱细胞，残留dsDNA降至29.2 ± 7.6 ng/mg，并保留富含胶原的ECM，具有不对称多孔微结构、快速溶胀、水合拉伸强度2.4 ± 0.4 MPa和可接受的细胞相容性。在猪创面中，与未处理创面相比，AFS在第7天和第11天显著增强早期再上皮化，并减少创周纹身区域的早期扩展，而屏障相关参数随时间正常化。重塑期间，AFS处理创面较未处理创面显示更高的总胶原和I型胶原沉积，且与对照品无显著差异。这些发现支持琥珀鱼皮作为可吸收创面覆盖ADM的有前景的海洋来源。
皮肤创面可由创伤、烧伤、手术切除、糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcers, DFUs）、压力性损伤和静脉性腿部溃疡（venous leg ulcers, VLUs）引起，全球临床和经济负担沉重。2022年全球创面护理支出达1486.5亿美元，且随老龄化和糖尿病、肥胖流行而预计增加；美国Medicare创面护理支出估计为每年281亿至968亿美元。深部真皮缺失创面常通过收缩和纤维化瘢痕形成愈合，而非再生正常皮肤结构。自体皮片移植仍是标准治疗，但受供区并发症、额外手术负担、疼痛和组织来源有限等限制。异体移植物及细胞或组织产品存在免疫反应、长期性能不稳定、成本高和皮肤结构与功能恢复不完全等问题。哺乳动物源ADM广泛使用，但强脱细胞和病毒灭活可改变ECM超微结构，去除糖胺聚糖、可溶性胶原和基质结合生长因子；还需控制猪内源性逆转录病毒和牛海绵状脑病相关朊病毒等风险，并可能受文化或宗教接受度限制。因此，需要现成、生物相容、具有生物活性、易获得、可顺应不规则创面并支持持久真皮重建的皮肤替代材料。鱼皮源ADM因胶原丰富、多孔纤维结构、可温和加工、与哺乳动物系统发育距离远、缺乏高免疫原性α-Gal表位及可能保留omega-3多不饱和脂肪酸（omega-3 polyunsaturated fatty acids, PUFAs）而受关注。但现有证据集中于鳕鱼和罗非鱼，物种差异对完整鱼皮源ADM性能的影响尚不清楚。日本琥珀鱼是东北亚重要海水鱼，养殖产量历史上超过15万吨/年，产生大量富胶原皮副产物。Bui et al. 曾将脱细胞琥珀鱼皮可溶组分加入混合生物墨水，体外显示增强细胞活力、成纤维细胞浸润和双层皮肤样构建，但未评价完整固态琥珀鱼源ADM的结构完整性或体内创面愈合潜力。因此，研究人员制备完整片状AFS，系统评价其理化特征、细胞相容性、大鼠皮下植入8周生物相容性和降解，并在猪全层创面模型中与商业鳕鱼皮ADM及未处理创面进行42天比较；目的不是证明优效，而是确定AFS是否满足安全标准并支持与临床用鱼皮ADM相当的愈合。这是首次对完整固态琥珀鱼皮源ADM进行临床前评价，也是首次在猪全层创面模型中对新鱼皮ADM与商业鱼皮产品进行头对头比较。
关键技术方法概括：研究人员从韩国Samsam Haemul Fisheries Association Corporation来源的日本琥珀鱼皮制备AFS，经脱细胞、脱色、冷冻干燥和灭菌。表征包括残留dsDNA、ECM组成（胶原、硫酸化糖胺聚糖（sulfated glycosaminoglycan, sGAG）、弹性蛋白）、衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（attenuated total reflectance–Fourier transform infrared, ATR-FTIR）、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）、孔隙率、溶胀和水合单轴拉伸。按ISO 10993-5用L929成纤维细胞提取物评价细胞毒性；按ISO 10993-6将AFS植入购自KOATECH的SD大鼠皮下8周。猪全层创面模型使用购自XPBio的3头雄性家猪，每头6个4 cm × 4 cm创面，随机分为AFS、商业鳕鱼皮ADM对照Kerecis Omega3 Wound和未处理，观察42天；检测再上皮化、创周纹身面积、经皮水分丢失（transepidermal water loss, TEWL）、角质层水合、H&E、Masson三色染色（Masson’s trichrome, MT）和I型胶原免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）。
2.1 琥珀鱼皮源ADM的制备与表征：通过脱细胞、脱色和冷冻干燥制备AFS。H&E染色显示多孔互联胶原网络且无可见细胞核；残留dsDNA从生鱼皮（raw fish skin, RFS）的21,286.0 ± 1003.0 ng/mg降至29.2 ± 7.6 ng/mg，约减少99.9%，低于常用50 ng/mg标准。ATR-FTIR显示酰胺A（3290 cm
?1）、酰胺I（1640 cm
?1）、酰胺II（1540 cm
?1）和酰胺III（1240 cm
?1）带在RFS与AFS中位置和形状相当。AFS含胶原434.1 ± 10.4 μg/mg、sGAG 31.0 ± 0.6 μg/mg和弹性蛋白25.3 ± 1.4 μg/mg。结论：有效去除细胞材料，并保留胶原丰富且含非胶原ECM成分的完整基质。
2.2 微结构、力学与生物相容性：SEM显示AFS具有明显不对称结构，内侧面为多孔疏松胶原纤维网络，截面为分层纤维束和空隙，外侧面较致密粗糙；乙醇置换法测得孔隙率29.1 ± 8.0%。生理盐水溶胀在5、10、30 s分别为194.0 ± 18.2%、252.3 ± 30.9%、310.3 ± 61.5%，1 min达321.3 ± 75.2%，随后稳定。水合拉伸呈J形曲线，拉伸强度2.4 ± 0.4 MPa，断裂伸长率59.6 ± 11.3%，初始杨氏模量0.8 ± 0.3 MPa（0–10%应变）。L929细胞提取物试验中细胞形态正常，活力80.3 ± 4.3%，高于ISO 10993-5的70%阈值。SD大鼠皮下植入8周无严重局部不良反应，植入物逐渐整合，第8周难以与宿主组织区分；炎症由第1周轻度浸润转为后期稀疏，并伴血管和宿主纤维结缔组织。结论：AFS具有可接受的细胞相容性和体内组织相容性，并可逐渐整合。
2.3 猪全层创面宏观愈合与皮肤屏障功能恢复：每头猪6个创面，每组4个创面。两种材料第1周粘附于创床，之后宏观不可区分。再上皮化在第7天AFS为25.0 ± 9.2%，对照为24.8 ± 9.2%，未处理为5.5 ± 3.1%（均p<0.05）；第11天AFS为37.9 ± 5.5%，未处理为21.7 ± 10.4%（p<0.05），对照为33.4 ± 5.3%且与未处理无显著差异；第14天后趋同，第42天三组分别为99.1 ± 0.3%、97.2 ± 2.9%、95.8 ± 3.7%，无显著差异。最早完全宏观闭合在AFS组于第28天出现1例，对照和未处理最早为第35天。创周纹身面积第7天未处理增至118.1 ± 11.0%基线，AFS和对照为101.6 ± 6.5%和99.2 ± 5.9%，显著低于未处理；第42天三组约74.1%、74.8%、71.9%，无显著差异。TEWL和角质层水合在早期高于正常皮肤，随后正常化，各时间点三组间无显著差异。结论：AFS增强早期再上皮化并限制早期创周扩展，但不加速或延迟屏障生理恢复。
2.4 组织学评价表皮再生与创面重塑：H&E显示第7天各组均有肉芽组织、出血、血管和密集炎症，AFS和对照有部分上皮覆盖，未处理较少；无异物肉芽肿。第14–28天上皮扩展、创床重塑、血管生成、肉芽和纤维增生，炎症逐渐减少。第42天上皮状态评分AFS为3.0 ± 0.0，对照2.8 ± 0.5，未处理2.5 ± 0.6；血管生成评分为2.8 ± 0.5、2.8 ± 0.5、3.0 ± 0.0；肉芽/纤维增生为3.5 ± 1.3、3.3 ± 1.3、4.3 ± 1.0；炎症均为1.5 ± 0.6，均无显著差异。第7–28天样本来自单只动物，为描述性。结论：组织学上AFS安全，后期各组无明显差异。
2.5 胶原沉积与真皮基质重塑：MT染色显示正常皮肤胶原面积86.3 ± 2.6%。第7天创伤组较低，第14天升高，第21天短暂下降；第28天未处理为32.7 ± 1.4%，AFS和对照为55.2 ± 5.5%和52.2 ± 6.9%。第42天AFS和对照胶原面积分别为65.2 ± 11.7%和62.5 ± 8.3%，显著高于未处理的49.7 ± 6.5%（均p<0.01）；AFS约为正常皮肤的76%，AFS与对照无显著差异。第7–28天为单只动物描述性。结论：AFS处理创面后期总胶原沉积更高。
2.6 I型胶原沉积：IHC显示正常皮肤I型胶原面积7.3 ± 1.1%。第7天三组约3.1–3.5%。AFS第14、21、28、42天分别为6.0 ± 2.0%、5.2 ± 1.1%、6.3 ± 1.1%、6.8 ± 1.7%；对照第42天为5.9 ± 1.9%；未处理第42天为2.9 ± 1.1%。第42天AFS和对照显著高于未处理（均p<0.001），分别约为正常皮肤的93%、81%和40%；AFS与对照无显著差异。结论：AFS处理创面后期I型胶原沉积更高。
讨论部分总结：有效脱细胞是异种ADM的前提。本研究满足Crapo et al. 常用三项标准中的两项，即残留dsDNA低于50 ng/mg且无可见细胞核；第三项残余DNA片段长度小于200 bp未评估，且仅用H&E而非DAPI评估核去除，因此解释脱细胞程度时需注意。ATR-FTIR提示胶原相关酰胺带保留，但未直接证明三螺旋结构或热变性温度，未进行差示扫描量热法（differential scanning calorimetry, DSC）。胶原为主要成分，但鱼胶原羟脯氨酸较低可能低估胶原含量；sGAG和弹性蛋白存在，但其生物活性未直接检测；脂质和脂肪酸未分析，omega-3是否保留未知。AFS具有不对称、多孔、致密外层结构，孔隙率低于其他冻干胶原海绵或鱼皮ADM，可能受材料、几何体积、表面吸干和干态测量影响；孔径分布、互连性和浸润深度未量化。水合AFS呈J形曲线，模量处于天然皮肤范围内并接近胶原膜和冻干支架，低模量和高伸长可能有利于顺应不规则创面。生物相容性由L929试验和大鼠植入支持。猪模型中AFS与对照早期促进再上皮化，但后期趋同，提示AFS主要缩短早期上皮覆盖滞后期；早期限制创周收缩可能有临床意义，但后期趋同。机制可能包括提供临时支架、机械限制收缩、维持湿润界面、轻度宿主反应和非胶原ECM成分作用，但未测生物标志物，且AFS与对照早期效应相似，提示可能为鱼皮ECM或治疗方案共有特征。屏障恢复各组相似，AFS未干扰正常恢复。胶原染色显示AFS后期总胶原和I型胶原面积较高，但MT和IHC仅反映胶原程度和分布，不说明成熟度、纤维组织或交联；也未区分宿主来源和支架来源胶原。AFS与商业对照在所有检测终点无显著差异，但研究并非等效性设计。限制包括第7–28天组织学来自单只动物，猪模型每组4个创面来自2只动物，创面并非完全独立，统计为探索性；使用健康年轻动物急性创面，非慢性受损创面；未处理组仅用纱布，材料组加泡沫敷料；42天未覆盖完整降解和长期瘢痕质量、真皮耐久性；未评估抗体交叉反应，MT/IHC不能区分新合成猪胶原和残留支架胶原；未检测炎症或再生生物标志物如CD68、CD206、CD31、Ki-67、细胞因子和生长因子；仅表征一个生产批次，批次和季节变异未评估。
结论翻译：本研究通过脱细胞和脱色工艺从日本琥珀鱼皮这一丰富海洋副产物制备了完整固态脱细胞真皮基质。该工艺将残留dsDNA降至29.2 ± 7.6 ng/mg干重，低于常用50 ng/mg阈值，同时保留胶原丰富（434.1 ± 10.4 μg/mg）、结构不对称的ECM。所得AFS快速水合，1 min内溶胀比321.3 ± 75.2%，水合状态拉伸强度2.4 ± 0.4 MPa，断裂伸长率59.6 ± 11.3%，初始杨氏模量0.8 ± 0.3 MPa。AFS具有细胞相容性（细胞存活率80.3 ± 4.3%），在8周皮下植入中仅引起轻度、短暂局部组织反应并逐渐整合。在猪全层创面模型中，AFS处理创面第7天再上皮化高于未处理（25.0 ± 9.2% vs. 5.5 ± 3.1%），创周纹身面积早期扩展较少（101.6 ± 6.5% vs. 118.1 ± 11.0%基线）。第42天，其胶原染色面积（65.2 ± 11.7% vs. 49.7 ± 6.5%）和I型胶原阳性面积（6.8 ± 1.7% vs. 2.9 ± 1.1%）更大。在本研究条件下，与商业可得的鳕鱼皮源创面基质在检测终点上无显著差异。这些发现支持琥珀鱼皮作为创面覆盖基质的海洋来源。仍需在更大队列和受损创面模型中进行充分把握度比较，并长期评估瘢痕质量和真皮耐久性，以确定其临床潜力。
