《Foods》：Searching for New Natural Compounds of Microbial Origin with Efficacy Against Listeria monocytogenes Biofilm Formation
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单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）引起李斯特菌病（listeriosis），这是一种相对罕见但严重的疾病，与高死亡率相关，尤其是在高风险人群中。为了减少其在食品生产环境中的存在，并通过识别和开发抑制单增李斯特菌（L. monocyto
单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）引起李斯特菌病（listeriosis），这是一种相对罕见但严重的疾病，与高死亡率相关，尤其是在高风险人群中。为了减少其在食品生产环境中的存在，并通过识别和开发抑制单增李斯特菌（L. monocytogenes）生物膜形成的新化合物来提高食品微生物安全性，本工作将高通量筛选（high-throughput screening, HTS）方法与微生物天然产物创新应用的探索相结合。研究人员建立了体外HTS测定实验条件，用于检测对消毒剂敏感的单增李斯特菌（L. monocytogenes）参考菌株（EGD-e，ATCC BAA-679）具有抗生物膜形成活性的微生物提取物。活性通过使用刃天青（resazurin）（一种氧化还原指示剂，可定量生物膜中的细胞活力）测量荧光进行评估。迄今为止，已测试1520个微生物提取物，其中127个基于其对EGD-e菌株的活性谱被选中。随后，这些提取物针对5株对消毒剂具有耐药性且从肉类工业中持续分离得到的单增李斯特菌（L. monocytogenes）菌株进行了测试，并检查了其色谱图谱，以根据其活性和已知分子的存在情况确定进一步研究的优先级。12个提取物显示出对5株耐药菌株的广谱生物膜形成抑制作用，其中3个是进一步进行生物活性导向分级分离和结构解析的候选物。进一步工作正在进行中，以表征这3个提取物的化学组成并探索其潜在应用，目标是开发可能具有较低环境影响的天然杀生物剂配方。
**论文解读**
**一、研究背景**
单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种机会性食源性病原体，具有特定毒力因子，可引起李斯特菌病（listeriosis），在高风险人群如老年人、新生儿、孕妇和免疫缺陷个体中死亡率高。该菌存在于水、土壤、食品、人和动物等多种环境，作为环境腐生菌高度适应严苛条件和竞争性微生物群。食品加工环境可促进其存活，并能在食品工业设施和设备上形成生物膜（biofilm），增加食品污染风险，导致食品安全和公共卫生问题及经济影响。生物膜相关细胞比浮游细胞更耐消毒剂，难以去除，可在食品生产区域长期持续。季铵盐化合物（quaternary ammonium compounds, QACs）耐药与外排泵决定簇 bcrABC 和 qacH 的获得或表达相关，但耐药、持续和生物膜形成不应视为可互换表型。浮游敏感性、表面定植和食品加工环境存活之间的关系仍需研究。微生物天然产物化学多样，是生物活性化合物发现的重要来源。Fundación MEDINA 天然产物库来自分类学、地理和环境层面多样的大型微生物保藏，覆盖广泛化学空间。天然来源化合物可能作为常规合成剂的替代。因此，本工作旨在建立高通量筛选（high-throughput screening, HTS）方法，寻找抑制 L. monocytogenes 生物膜形成的微生物提取物，并优先识别干扰生物膜形成的提取物。
**二、研究概况与意义**
研究人员建立体外HTS测定，以消毒剂敏感的 L. monocytogenes 参考菌株 EGD-e（ATCC BAA-679）筛选1520个微生物提取物，基于活性选择127个，再用5株从肉类加工厂持续分离的消毒剂耐药菌株测试，并检查色谱谱以优先进一步研究。12个提取物对5株耐药菌株显示广谱生物膜形成抑制，其中3个候选用于进一步生物活性导向分级分离（bioactivity-guided fractionation）和结构解析（structural elucidation）。研究结论认为，该研究提供稳健筛选工具，可适用于生物膜研究领域，并开启利用更大天然产物（natural products, NPs）集合筛选的可能性；微生物产物是潜在新型抗菌剂的无限来源，为可持续有效控制细菌污染，尤其食品工业应用，提供有前景替代方案。
**三、关键技术方法（不超过250字）**
采用体外HTS生物膜测定，以刃天青（resazurin, RSZ）荧光法作为代谢读数评估生物膜细胞活力；测试对象为 L. monocytogenes EGD-e（ATCC BAA-679）。微生物提取物来自 Fundación MEDINA 天然产物库子集1520个，其中细菌218株来自西班牙 Granada 和 Almeria 干旱环境土壤、地衣、植物根际，真菌158株来自南非 Cape、Cederberg、Namaqualand、Free State 的 fynbos 和 restios 根际。活性提取物进一步对5株苯扎氯铵耐药（BAC-resistant, BAC-r）L. monocytogenes（S1、S10-1、S2-2、S2-3、S10-3）测试，这些菌株来自肉加工厂，包括序列型（sequence type, ST）ST31和ST121等。采用液相色谱-高分辨质谱（liquid chromatography–high-resolution mass spectrometry, LC-MS）去重复化（dereplication），与 Fundación MEDINA 数据库、Chapman & Hall Dictionary of Natural Products、Natural Products Atlas 和 Lotus 比对。
**四、研究结果**
**3.1 Biofilm HTS Assay and Hit Selection（生物膜HTS测定与命中选择）**
研究人员评估HTS可重复性和敏感性，对环丙沙星（ciprofloxacin）和苯扎氯铵（benzalkonium chloride, BAC）测定浮游和生物膜剂量反应。ciprofloxacin 和 BAC 的 MIC
90%（minimum inhibitory concentration，最低抑菌浓度）均为1.5 μg/mL；ciprofloxacin 的 MBIC
90%（minimum biofilm inhibitory concentration，最低生物膜抑制浓度）>50 μg/mL，BAC 为16 μg/mL；MBIC/MIC 比分别高于30倍和10倍。DMSO ≤1.82% 对生物膜形成无影响。1520个提取物在单浓度2× WBE（whole broth equivalent，全发酵液当量）下筛，最终0.182 WBE和1.82% DMSO。RZ′因子（robust Z′ factor）0.86–0.93，信号/背景比（signal to background, S/B）6.2–7.3，支持稳健性和可重复性。127个提取物（65来自48株放线菌，62来自50株真菌）因对EGD-e生物膜形成抑制≥60%被选。活性放线菌来自12属7科，多为根或土壤/植物根际来源；50株活性真菌中15株鉴定到11属9科5目，显示多样性。
**3.2 Early LC-MS Dereplication（早期LC-MS去重复化）**
对127个活性提取物进行LC-MS去重复化。43个含已知化合物如nocardamine、deferoxamine、rifamycin和phenazines等；28个色谱信号很低；56个未在 Fundación MEDINA 微生物代谢物数据库或 Chapman & Hall Dictionary of Natural Products 中匹配。无数据库匹配不等于化学新颖或生物活性证据。
**3.3 Biofilm Assays with Disinfectant-Resistant L. monocytogenes Strains（耐消毒剂L. monocytogenes菌株的生物膜测定）**
127个提取物对5株BAC-r L. monocytogenes测试，78个无活性，49个对至少1株有抑制。49个中（30来自27株放线菌，19来自14株真菌），12个（5个放线菌，7个真菌）对全部5株BAC-r菌株有生物膜形成抑制。5个放线菌属于 Micromonosporaceae（Micromonospora vinacea、Pseudosporangium ferrugineum、Planctatinospora sonchi）、Nocardiopsis umidischolae 和 Glycomyces sambucus，均来自西班牙 Granada 的 El Margen 和 Los Vados 根和根际样本。Micromonosporaceae 成员LC-MS信号很低，活性未关联具体成分；Nocardiopsis 和 Glycomyces 产生铁载体（siderophores）deoxynocardamine（Terragine E）和nocardamine，已有抗革兰阳性病原体生物膜形成活性。7个真菌提取物来自5株南非土壤根际菌株，3株形态鉴定为 Pyrenochaetopsis、Clonostachys 和 Maroammaea，2株未鉴定。未鉴定种提取物检测到细胞毒性化合物 trichosetin、beauvericin、helvolic acid 和 sesquicillins；Pyrenochaetopsis 产生 phomasetin 和 altersetin，已有抗革兰阳性菌活性。Clonostachys 和 Maroammaea 未检测到已知分子。12个最有趣提取物中，仅3个无数据库匹配：2个来自真菌 Mariannaea sp. 和 Clonostachys rosea，1个来自放线菌 Micromonospora vinacea。
**五、讨论与结论**
讨论认为，食品加工环境中 L. monocytogenes 生物膜控制仍是重大挑战，生物膜促进其在食品接触表面持续并可能增加抗菌干预耐受。本研究通过初级筛选流程结合HTS和微生物天然产物新应用。据研究人员所知，这是首个将大型微生物天然产物提取物库HTS与LC-MS去重复化及随后针对食品加工环境分离的BAC-r L. monocytogenes 菌株面板评估相结合的研究。HTS方法适合评估化合物对生物膜形成的影响，统计值和一致BAC MIC支持其可重复性和敏感性。研究强调区分抗生物膜形成活性与抗浮游细胞常规抗菌活性。ciprofloxacin和BAC的MIC与MBIC与生物膜细胞比浮游细胞更耐受一致。127个提取物中56个无数据库匹配，被优先进一步研究，但无匹配不等于化学新颖或生物活性证据。植物来源化合物如 trans-cinnamaldehyde、carvacrol、thymol 和 eugenol 可抑制 L. monocytogenes 生物膜，支持天然产物可提供多样分子干扰生物膜发育；但本研究探索微生物提取物作为结构多样次生代谢物来源。使用耐消毒剂菌株是额外特点。49个抑制至少1株BAC-r，12个对整个面板及EGD-e有活性，说明初级筛选有效富集多耐药菌株活性提取物。两个主要类型为 prfA 突变株 S1（ST31）和含 Tn6188 的 ST121 菌株，均为即食（ready-to-eat, RTE）猪肉产品生产厂清洁消毒表面持久污染物。比较基因组分析提示两个ST具有不同抗菌和应激抗性基因。四株ST121含与 qacH 相关的 Tn6188，可能增强QAC存活；还含镉抗性转座子 Tn5422 和 clpL 基因。S1发现 Tn5422 样转座子与 cadA1 相关；ST31长持续可能与应激生存岛1（stress survival islet 1, SSI-1）区域有关。活性跨面板表明抗生物膜效果不限于单一消毒剂耐药遗传背景，但未确定是否克服BAC耐受特定机制。若干活性提取物含已知抗菌代谢物，如 altersetin、phomasetin。仅3个最有趣提取物无数据库匹配，来自 Mariannaea sp.、Clonostachys rosea 和 Micromonospora vinacea，均从根际分离，正在纯化和结构解析。粗提取物评估不能确定单个代谢物贡献，可能有协同或相加效应。研究未评估这些发现影响，但为开发天然环境可持续剂提供基础。结论部分翻译：本研究提供了一个稳健的筛选工具，在生物膜研究领域具有潜在适用性，并开启了使用更大天然产物（NPs）集合进行筛选的可能性，因为研究人员的方法满足高通量筛选（HTS）药物发现的严格要求。此外，研究人员的项目强化了微生物产物是潜在新型抗菌剂无限来源的观念，为可持续且有效地控制细菌污染提供了有前景的替代方案，尤其是在食品工业应用中。
