发酵野生菊苣（Cichorium intybus L.）叶的植物化学轮廓与抗氧化潜力：Lactiplantibacillus plantarum单菌及与Saccharomyces cerevisiae共培养研究

《Foods》：Fermented Wild Chicory (Cichorium intybus L.) Leaves as a Promising Food Ingredient: Phytochemical Profile and Antioxidant Potential

　　

野生菊苣（Cichorium intybus L.）是一种自然分布广泛的地中海植物，传统上用于食品和草药，因其含有大量具有抗氧化活性的生物活性化合物。乳酸发酵（lactic acid fermentation）作为一种温和技术策略，正日益被探索用于调控蔬菜基质的植物化学和功能特征，但其对野生菊苣叶的影响在很大程度上尚未表征。在本研究中，新鲜野生菊苣叶采用受控发酵，所用接种悬浮液含10⁶ cells/mL的植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），单独或与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，10³ cells/mL）共培养，在37 °C下发酵24和48 h。用L. plantarum单独或共培养发酵均在24 h内快速且显著地将pH从约5.5降至4.3。总黄酮含量（total flavonoid content，TFC）、DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，2,2-二苯基-1-苦基肼基）试验、FRAP（ferric reducing antioxidant power，铁还原抗氧化能力）和ORAC（oxygen radical absorbance capacity，氧自由基吸收能力）观察到显著的时间效应，而总酚含量（total phenolic content，TPC）未观察到显著时间效应。跨处理平均，发酵后黄酮含量下降，DPPH在24 h出现短暂升高，FRAP在48 h显著低于基线，ORAC在两个发酵时间点均升高。对野生叶的描述性UPLC-DAD（ultra-performance liquid chromatography-diode array detection，超高效液相色谱-二极管阵列检测）分析显示未发酵样品与发酵24 h样品之间存在差异。菊苣酸（chicoric acid）仅在未发酵样品中检出，而咖啡酸（caffeic acid）和3,4-O-咖啡酰奎宁酸（3,4-O-caffeoylquinic acid）在发酵样品中检出。在黄酮中，还检出山柰酚-3-O-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-glucoside）、芦丁（rutin）和木犀草素（luteolin），其相对丰度随发酵而变化。这些发现突出了发酵后野生菊苣叶提取物植物化学轮廓和体外抗氧化能力的明显变化，并支持进一步研究发酵材料作为潜在食品配料。

野生菊苣（Cichorium intybus L.）是原产欧洲和亚洲、现已归化于多数温带地区的多年生草本植物，长期作为叶菜使用，并因含酚酸、黄酮和倍半萜内酯而受到关注。已有研究报道，不同地理来源和栽培制度下的C. intybus叶富含羟基肉桂酸衍生物（包括菊苣酸和绿原酸）以及木犀草素、芹菜素、槲皮素和山柰酚糖苷等黄酮。发酵是古老食品生物技术，目前作为低成本、低能耗调控植物性食品营养和功能特性的策略重新受到关注。根据国际益生菌和益生元科学协会（International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics，ISAPP）共识，发酵食品是通过受控微生物生长和食品组分酶转化产生的食品或饮料。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB），尤其是L. plantarum，因具有酸化、蛋白水解和酶活性而广泛用于蔬菜发酵，可将糖基化酚类水解为苷元，从而调节发酵基质的酚类谱和抗氧化能力。但效应方向和幅度强烈依赖基质和菌株：一些蔬菜发酵研究报告可提取酚类和抗氧化能力增加，另一些则变化可忽略甚至酚类池降低。此前菊苣发酵主要研究红色菊苣副产物，接种选定L. plantarum可改善抗自由基和抗菌性质。据研究人员所知，尚无研究专门考察野生菊苣叶的发酵剂驱动发酵，也未比较L. plantarum单菌与涉及S. cerevisiae的共培养发酵。因此，研究人员旨在评估新鲜野生菊苣叶经L. plantarum单独或与S. cerevisiae共培养受控乳酸发酵后，对TPC、TFC及通过DPPH、FRAP和ORAC三种互补试验评估的体外抗氧化能力的影响，并通过UPLC-DAD评估发酵后的植物化学成分，指出不同化学类别（酚类、羟基肉桂酸和黄酮）的主要极性成分。该策略可能有助于将这种自然生长且目前未充分利用的植物增值为新型发酵蔬菜产品。

关键技术方法概述：研究人员于2025年11月从意大利比萨省Calci的Certosa di Calci自然生长植株采集花后新鲜野生菊苣叶，凭证标本（n. 69934和69935）保存于比萨大学植物园。将约20 g新鲜叶机械破碎后，分别接种L. plantarum（10⁶ cells/mL）单独或与S. cerevisiae（10³ cells/mL）共培养，在37 °C、120 rpm下发酵48 h，于0、24、48 h取样。测定pH；冻干材料用80%乙醇提取。采用Folin–Ciocalteu法测TPC，AlCl₃法测TFC，DPPH、FRAP和ORAC测抗氧化能力；以UPLC-DAD描述未发酵与24 h发酵样品酚类谱；用两因素重复测量ANOVA分析TPC、TFC及抗氧化数据。

3.1 pH Changes During Fermentation（发酵过程中pH变化）：通过pH测定，T0所有样品呈弱酸性（约5.5），两接种条件无显著差异。LP和LP + SC在24 h内快速显著酸化，pH分别为4.41 ± 0.18和4.41 ± 0.01，48 h基本稳定在4.43 ± 0.14和4.34 ± 0.06。结果表明L. plantarum接种驱动典型乳酸型发酵，并在24 h内达到稳定发酵平衡。

3.2 Total Phenolic and Flavonoid Content and Antioxidant Capacity（总酚、总黄酮含量和抗氧化能力）：通过两因素重复测量ANOVA分析。TPC和TFC均未显示发酵处理或时间×处理交互显著效应；TPC无显著时间效应（F(2,4) = 2.759，p = 0.177），T0为3.795 ± 0.049 mg GAE/g，LP在24和48 h分别为3.541 ± 0.371和3.306 ± 0.061 mg GAE/g，LP + SC分别为3.717 ± 0.490和3.439 ± 0.404 mg GAE/g。TFC随时间显著变化（F(2,4) = 23.941，p = 0.006），跨处理从T0的9.437 ± 0.000 mg CE/g降至24 h的6.994 ± 0.632和48 h的7.178 ± 0.883 mg CE/g，两个发酵时间点均显著低于T0，24与48 h无显著差异。抗氧化方面，处理和时间×处理交互均不显著。DPPH随时间显著变化（F(2,4) = 21.409，p = 0.007），24 h为1.095 ± 0.160 mg TE/g，显著高于T0的0.909 ± 0.068和48 h的0.853 ± 0.062 mg TE/g，后两者无显著差异。FRAP随时间显著变化（F(2,4) = 14.470，p = 0.015），48 h为27.126 ± 1.989 μmol Fe²⁺E/g，显著低于T0的36.970 ± 0.000 μmol Fe²⁺E/g；24 h为33.189 ± 3.781 μmol Fe²⁺E/g，与两者均无显著差异。ORAC随时间显著变化（F(2,4) = 32.954，p = 0.003），从T0的31.570 ± 4.073 μmol TE/g增至24 h的42.191 ± 1.215和48 h的42.003 ± 3.058 μmol TE/g，均显著高于T0，约增加34%和33%，两者无显著差异。

3.3 Phytochemical Profile of Unfermented and Fermented Chicory Leaves（未发酵与发酵菊苣叶植物化学轮廓）：通过描述性UPLC-DAD比较未发酵和24 h发酵提取物。黄酮中，未发酵样品检出kaempferol-3-O-glucoside（40.68 ± 0.01 mg/100 g）和rutin（66.08 ± 0.43 mg/100 g）；发酵后rutin未检出，kaempferol-3-O-glucoside降至LP的19.08 ± 0.46和LP + SC的11.78 ± 0.02 mg/100 g。Luteolin在未发酵和LP发酵样品中低浓度检出（6.09 ± 0.01和7.13 ± 0.09 mg/100 g），LP + SC中未检出。羟基肉桂酸方面，chlorogenic acid从未发酵的66.70 ± 0.54降至LP的19.53 ± 0.36和LP + SC的4.92 ± 0.30 mg/100 g。3,4-O-caffeoylquinic acid和caffeic acid在未发酵样品中仅痕量、低于线性下限，发酵后检出，LP中分别为14.03 ± 0.09和7.77 ± 1.37 mg/100 g，LP + SC中分别为22.10 ± 1.04和16.25 ± 1.64 mg/100 g。整体上，发酵伴随酚类谱重塑，未发酵中某些化合物耗竭，另一些化合物出现。

讨论部分总结：pH在24 h降至约4.3–4.4，两接种处理一致，符合L. plantarum在蔬菜基质中的酸化活性，有机酸产生可降低pH并有助于微生物稳定性；24至48 h变化有限，表明多数酸化发生在最初24 h。但pH测量不能提供微生物安全或接种微生物生长、活力和代谢活性信息，因为未做微生物计数和有机酸分析。未接种对照在24 h出现可见霉菌生长并被排除，因此与T0比较不能完全区分发酵剂相关变化与孵育或内源微生物活性相关变化。TPC稳定与其他LAB发酵蔬菜酚类显著降低的报道相反，但与某些精选发酵剂促进酚类释放或转化而无TPC净变化的研究一致，说明乳酸发酵对TPC的影响强烈依赖基质、微生物和过程。TFC和抗氧化反应出现时间依赖性变化，但未检测到发酵剂组成或处理×时间交互效应。TFC低于T0可能反映黄酮谱和/或可提取性差异；LAB发酵植物基质有糖苷酶介导转化报道，但本研究未研究酶活或具体转化途径。三种抗氧化试验模式不同：DPPH在LP 24 h短暂增加、48 h下降，LP + SC接近或略低于未发酵；FRAP基于电子转移反应，发酵后显著降低，尤其48 h；ORAC显示发酵提取物体外过氧自由基清除能力增强，与氢原子转移（hydrogen-atom-transfer，HAT）反应及过氧自由基的生物学相关性有关，且测定条件较接近生理pH和温度；Sadowska-Bartosz等认为ORAC是测定食品抗氧化能力的有效方法。但ORAC增加不应解释为整体抗氧化能力改善，因为DPPH和FRAP反应不同。UPLC-DAD显示，尽管TPC相对稳定，未发酵与发酵样品单个酚类分布不同：kaempferol-3-O-glucoside减少，rutin未检出，luteolin低水平或在LP + SC未检出，提示黄酮组分改变；但未检出相应苷元，不能将变化归因于特定去糖基化途径。chlorogenic acid减少，而未发酵未检出的3,4-O-caffeoylquinic acid和caffeic acid发酵后检出；chlorogenic acid减少和其他咖啡酰衍生物出现与微生物介导的咖啡酰奎宁酸部分修饰相容，可能涉及水解和/或异构化过程。chicoric acid未发酵检出、发酵后未检出，4-O-caffeoylquinic acid变化较小且依赖发酵。总体UPLC-DAD表明发酵重塑单个酚类谱而非普遍耗竭，这为TPC相对稳定与TFC和抗氧化活性变化之间的表观差异提供可能解释：当一些化合物耗竭伴随其他化合物形成、释放或可提取性增加时，TPC等全局试验可能相对不变，但酚类混合物化学性质可能不同。FRAP和ORAC差异与酚类谱变化同时出现，但未做定量相关或机制实验，因此不能根据本研究数据将抗氧化变化归因于特定酚类化合物。LP单菌与LP + SC差异提示发酵剂组成可能影响植物化学变化的程度和方向：两者酸化动力学相似且TPC响应相近，但部分单个化合物浓度因接种不同而不同，尤其LP + SC中3,4-O-caffeoylquinic acid和caffeic acid更高、chlorogenic acid耗竭更强，提示S. cerevisiae的存在可能影响发酵过程中单个酚类化合物的分布和演变。涉及S. cerevisiae与乳酸菌混合发酵的类似接种依赖差异已有报道，支持发酵剂组成可影响酚类变化程度和方向。研究结果支持进一步研究发酵野生菊苣叶作为潜在食品配料，但微生物安全、储藏稳定性、感官特性及加入食品后的表现仍需评估；需结合高分辨率LC-MS/MS（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，液相色谱-串联质谱）、发酵全过程单个代谢物定量监测和生物可及性评估，以阐明变化的机制和营养相关性。

结论翻译：用L. plantarum单独或与Saccharomyces cerevisiae共培养发酵野生菊苣叶，与24 h内酸化及总酚含量基本不变相关。TFC、DPPH、FRAP和ORAC随发酵时间显著变化，而发酵处理及其与时间交互作用均无显著影响。描述性UPLC-DAD分析表明样品中单个酚类谱发生变化，但不能确立生物处理差异。这些发现强调了在评价发酵相关变化时互补抗氧化试验的价值。尽管本研究具有探索性和局限性，该工作对当地采集的野生菊苣——一种尚未充分利用的野生植物资源——的发酵进行了初步研究。有必要进一步研究，将更广泛的植物化学表征与生物利用度、营养和功能研究相结合，以更好阐明发酵野生菊苣叶作为食品配料的潜力。