联合电穿孔与吖啶橙（AO）蓝光LED光疗抗黑色素瘤细胞实验方案的开发与优化

《International Journal of Molecular Sciences》：Development of an Experimental Protocol for Combined Electroporation and Phototherapy Treatment Against Melanoma Cells

黑色素瘤（melanoma）是最常见的皮肤肿瘤，成功的药物治疗面临重大挑战。本研究的目的是确定基于电穿孔（electroporation）和吖啶橙（acridine orange, AO）光激活（photoactivation）的联合治疗的最佳治疗条件，该治疗使用Biopulse srl设计的蓝色LED灯（blue LED lamp）。通过MTT法（MTT assay）和光学显微镜观察（optical microscopy observations）研究联合治疗的效果。通过流式细胞术（flow cytometry）分析药物摄取（drug uptake）和凋亡（apoptosis）诱导。最佳治疗方案为使用电脉冲（序列为八个双相脉冲，持续50 + 50 μs，脉冲间隔300 μs，电压300 V），AO浓度为0.01 μg/mL，LED暴露30 s。联合治疗对黑色素瘤细胞比对人真皮成纤维细胞-成人细胞（human dermal fibroblast-adult cells）更有效。结果表明，电穿孔增加了AO积累，允许降低药物浓度和暴露时间。该组合诱导了与凋亡特征一致的程序性细胞死亡（programmed cell death），如细胞周期（cell cycle）分析所示。这些初步结果表明基于电穿孔和AO光疗的组合治疗对黑色素瘤细胞有效，并鼓励在兽医肿瘤学中测试其在黑色素瘤模型中的功效的可能性。

皮肤肿瘤是当前最危险和广泛传播的癌症形式之一。在诊断的皮肤癌中，20%为皮肤黑色素瘤（melanoma）。国际癌症研究机构（IARC）预测，2020年全球新诊断325,000例黑色素瘤，57,000人死于该病；近期研究预测2020年至2040年黑色素瘤发病率将上升超过50%。黑色素瘤转移的治疗包括靶向治疗、免疫治疗，对无反应肿瘤使用化疗；同时电化学治疗限于皮肤转移的姑息治疗。目前作为最后线治疗的化疗药包括达卡巴嗪、替莫唑胺、铂类化合物如卡铂，以及紫杉烷类如紫杉醇。尤其对于皮肤转移，在免疫治疗或检查点抑制剂未能实现局部控制时，需要新型二线治疗。改善肿瘤局部控制的策略之一是将某些药物与光激活结合。光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）已被研究用于广谱疾病，主要用于浅表和局部可及病变，如光化性角化病、Bowen病、皮肤鳞状细胞癌和黑色素瘤。与常规全身治疗相比，PDT的潜在优势是局部治疗活性，从而限制对周围健康组织的损伤。其作用机制包括活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生、凋亡诱导和免疫反应调节。生物反应取决于光敏剂化学、细胞内定位、光强、肿瘤细胞氧可用性和靶细胞分子环境。已证明使用吖啶橙（acridine orange, AO）的光动力或放射动力治疗（分别称为AO-PDT和AO-RDT）在实验和临床肿瘤环境中具有显著特异性和有效性。AO已被广泛用作光敏剂、抗癌药和抗疟药。其分子小，可快速进入靶细胞及其细胞器。当AO被蓝光（约490 nm）或X射线激发时，发射绿色荧光（约525 nm）并产生ROS，促进细胞死亡。该特性已被用于治疗实体瘤，利用AO倾向结合酸性环境如肿瘤内环境的特点。最后，在增强肿瘤细胞药物摄取的策略中，电穿孔（electroporation）因高效而受到科学界关注。尽管黑色素瘤治疗取得进展，仍需要有效且耐受良好的疗法。本研究的目标是评估AO暴露于透化脉冲是否导致靶细胞摄取增加，以及随后暴露于激发蓝光是否导致有效性增加和促进凋亡细胞死亡。

研究人员开展了体外研究，使用A375黑色素瘤细胞和人真皮成纤维细胞-成人（HDF-Ad）评估AO光激活联合电穿孔的效果。结论表明，最佳方案为电脉冲八个双相脉冲，持续50 + 50 μs，脉冲间隔300 μs，电压300 V，AO浓度0.01 μg/mL，LED暴露30 s。联合治疗对黑色素瘤细胞比HDF-Ad更有效。电穿孔增加AO积累，允许降低药物浓度和暴露时间，并诱导与凋亡特征一致的程序性细胞死亡。这些初步结果表明联合治疗对黑色素瘤细胞有效，鼓励在兽医肿瘤学中于黑色素瘤模型测试疗效。

关键技术方法概括（不超过250字）：使用A375细胞（ATCC CRL-1619）和HDF-Ad细胞（Cytion 300606）。电穿孔由改良临床电穿孔仪Onkodisruptor^?-Lab（Biopulse Biotech, Rome, Italy）产生双相电脉冲，八个脉冲，50 + 50 μs，300 μs间隔，300 V，名义场强750 V/cm，总时间3.2 ms。蓝光由自制装置提供，含六个3 W LED，峰值波长460 nm，光通量55 lumens，110°光束角，辐照度50 ± 15 mW/cm²，10、30、60 s对应0.5、1.5、3 J/cm²。细胞活力用MTT法，形态用相差显微镜，AO摄取和细胞周期用流式细胞术，统计用单因素方差分析（ANOVA）及Bonferroni和Dunnett事后分析。

研究结果：

2.1 吖啶橙（AO）和LED暴露对人黑色素瘤细胞的影响（The Effects of AO and LED Exposure on Human Melanoma Cells）。通过MTT法在1、4、24 h评估AO-PDT对A375细胞的效果，测试AO浓度0.1–0.5–1.0–2.0 μg/mL和LED暴露30或60 s。LED单独暴露在1 h引起细胞活力轻微下降，4和24 h恢复。AO联合LED在1 h或4 h于0.5、1或2 μg/mL浓度轻微有效，24 h在所有AO浓度下效果很强且明显。相差显微镜观察24 h确认MTT数据：LED单独暴露细胞形态与未处理细胞相同；随AO浓度增加，细胞核越来越肿胀；LED激活AO后，许多细胞脱离基质，贴壁细胞失去多边形形态。结论是LED暴露可有效激活AO药物作用于A375黑色素瘤细胞。

2.2 AO和LED暴露对人真皮成纤维细胞-成人（HDF-Ad）的影响（The Effects of AO and LED Exposure on Human Dermal Fibroblasts—Adult (HDF-Ad)）。通过MTT法在24 h评估AO和LED暴露对HDF-Ad活力的影响。LED单独30 s未引起显著活力变化。AO 0.1 μg/mL无论是否LED暴露均未显著降低活力。AO 0.5 μg/mL引起中度活力降低，联合LED更明显。最高浓度1 μg/mL无光时活力与0.5 μg/mL相似，联合LED导致活力显著降低约50%。光学显微镜观察确认：LED单独与对照相似；0.1 μg/mL AO无论有无光均与对照相似；0.5 μg/mL AO加LED出现密度下降和形态轻微改变；1 μg/mL AO加光后形态改变和细胞数减少更明显，细胞失去黏附并变圆。结论是较高浓度AO光激活对HDF-Ad有轻度毒性，但弱于对A375细胞。

2.3 电穿孔对接受AO和LED暴露治疗的A375黑色素瘤细胞的疗效（The Efficacy of Electroporation on A375 Melanoma Cells Treated with AO and LED Exposure）。通过MTT法24 h评估电穿孔联合AO光疗。测试两种模式：较高AO浓度联合较短LED暴露10 s；较低AO浓度0.01 μg/mL联合LED暴露30 s。电穿孔降低A375细胞在所用较高AO浓度下的活力，联合LED 10 s时两种浓度细胞活力约5%。光学显微镜确认。另一模式中，AO 0.01 μg/mL单独处理后电穿孔使活力约65%，比单独处理降低约20%；AO 0.01 μg/mL光激活30 s仅轻微降低活力；电穿孔加AO 0.01 μg/mL再加LED 30 s后细胞活力约14%。光学显微镜确认三重组合诱导明显形态变化。结论是AO 0.01 μg/mL和LED 30 s是联合电穿孔的最佳治疗条件。

2.4 电穿孔对AO胞内积累的影响（The Effect of Electroporation on AO Intracellular Accumulation）。利用AO自发荧光特性，通过流式细胞术评估电穿孔是否增加AO胞内积累。A375细胞电穿孔后以不同AO浓度0.01、0.05、0.1、0.5 μg/mL处理30 min或3 h。30 min时，电穿孔加0.01、0.05和0.1 μg/mL AO的细胞绿色荧光信号较未电穿孔细胞增加。该效应仅在短时间30 min出现，3 h后所有浓度和两个荧光通道均稳定。结论是电穿孔增加药物在黑色素瘤细胞内的保留，从而增强光激活AO的毒性作用，尤其在低浓度下；提示可逆电穿孔介导的瞬态膜透化。

2.5 联合治疗对细胞周期分布的影响（The Effect of the Combined Treatments on Cell Cycle Distribution）。通过DNA染色流式细胞术在24和48 h分析细胞死亡机制。24 h未显示细胞周期显著改变。48 h时，单独电穿孔或单独光照的细胞周期各期与未处理细胞相比无显著改变。AO 0.01 μg/mL加LED 30 s后出现pre-G1峰18.9%，确认AO激活。电穿孔后加AO处理再加LED时pre-G1明显增加至约52.3%。S和G₂/M等其他期未观察到改变。结论是黑色素瘤细胞电穿孔后经AO光激活诱导了与凋亡特征一致的程序性细胞死亡。

讨论部分总结：动态光疗涉及使用光敏分子作为化疗剂并通过可见光激活。AO作为光敏剂特别有利，因其具有中等系统毒性并能够选择性靶向肿瘤细胞。AO-PDT广泛用于皮肤肿瘤包括黑色素瘤，因皮肤肿瘤位于体表、易于光照射。药物依赖光激活赋予治疗高空间和时间选择性，使细胞毒作用限于靶区并减少对周围健康组织的损伤，优于放疗、化疗和广泛手术切除。初步阶段通过MTT法和显微镜观察评估光疗对A375细胞不同AO浓度和蓝光暴露时间的细胞毒效果，结果在1、4、24 h分析，短时间效果中等，24 h细胞活力显著降低，尤其LED光激活后；AO效果呈剂量和时间依赖性。据此选择低于1 μg/mL的AO浓度和低于30 s的灯暴露时间用于后续实验。随后在HDF-Ad上评估不良效应，最高浓度1 μg/mL有毒性但弱于A375细胞，提示黑色素瘤细胞更敏感。该选择性可归因于肿瘤细胞更酸性的细胞内环境和更高核酸含量，有利于AO胞内积累。既往研究表明电穿孔可增强多柔比星和丝裂霉素C等化疗剂的积累和疗效。基于此，假设电穿孔可增加AO摄取和疗效，从而减少药物浓度和/或LED暴露时间。测试两种模式后发现较短10 s暴露仍足以诱导细胞活力显著降低；从临床角度，减少光照时间可缩短治疗过程并改善耐受性。低AO浓度0.01 μg/mL加30 s LED时，联合电穿孔较单独AO加光显著降低活力，有减少药物副作用的潜在临床意义。相差显微镜图像确认MTT数据，显示与细胞死亡一致的形态改变，且明显呈剂量和光依赖性。流式细胞术AO积累分析确认初步观察：30 min时电穿孔加AO处理的样本AO积累显著增加，尤其绿色荧光通道，提示核定位；3 h后平均荧光在电穿孔/处理细胞与未电穿孔处理细胞间相当，提示可逆电穿孔介导的瞬态膜透化。电脉冲后质膜形成瞬时孔改善药物胞内摄取并达到核靶；随后膜完整性恢复和调节机制激活可能降低药物胞质浓度。细胞周期分析在48 h显示pre-G1低二倍体群体增加，三联合组最明显，清楚表明激活了与凋亡特征一致的程序性细胞死亡。这些数据与MTT法不完全一致，但两种分析研究不同生物学终点：MTT法测量线粒体损伤及代谢活性降低，细胞周期分析突出DNA改变。AO经光激活产生ROS，氧化应激先损害线粒体功能，损伤线粒体又放大ROS产生并释放促凋亡蛋白，触发程序性细胞死亡级联。该时间进程可解释代谢活力降低与凋亡分数出现之间的时序差异。结论是程序性细胞死亡与凋亡特征一致，既由于对DNA的直接作用，如光学观察和AO摄取流式细胞术分析所示，也由于放大的氧化应激，如文献数据所记录。

研究结论翻译：总之，本研究表明，电穿孔与AO光疗的组合是黑色素瘤治疗的一种有前景的策略，能够增强治疗效果，同时降低全身毒性。这些在黑色素瘤2D模型上获得的结果，将在由A375细胞、HDF-Ad和角质形成细胞（HaCaT）组成的3D多细胞模型上加以确认，该模型由研究人员所在团队优化。这些体外数据将为使用转移性黑色素瘤动物模型启动兽医肿瘤学研究提供可能性。