大熊猫与海洋肉食动物嗅觉受体基因的相似退化模式

《iScience》：Similar degenerative patterns of olfactory receptor genes in the giant panda and marine carnivores

　　

## 亮点

- 海洋食肉目动物与以竹子为食的食肉目大熊猫表现出趋同的嗅觉受体基因退化
- 栖息地在食肉目物种中主要决定完整嗅觉受体基因的数量
- 饮食专化性主导了嗅觉受体基因的假基因化水平和选择性约束

## 摘要

嗅觉受体（OR）基因构成了哺乳动物中最大的基因家族，对嗅觉感知和生态适应至关重要。嗅觉受体基因的变异与物种间在栖息地、饮食和感官依赖方面的差异有关，但这些生态因素对嗅觉受体基因演化的相对贡献尚不清楚。本研究系统地分析了占据多样化生态位的25种食肉目物种的嗅觉受体基因库。海洋食肉目动物表现出趋同的嗅觉受体基因退化，与陆生物种相比，完整基因和祖先直系同源基因数量更少，假基因比例更高，净化选择更为松弛。值得注意的是，以竹子为食的食肉目大熊猫展现出相同的退行性特征，在陆生食肉目动物中拥有最小的完整嗅觉受体基因库和最多的丢失祖先嗅觉受体基因组。我们的模型表明，栖息地主要影响完整嗅觉受体基因的数量，而饮食专化性则主导假基因化和选择性约束。这些发现揭示了水生适应和极端饮食专化条件下的嗅觉受体功能退化趋同现象，阐明了生活方式与哺乳动物化学感觉基因组演化之间的复杂联系。

## 引言

嗅觉是动物最重要的感觉模态之一，在感知环境、寻找食物、选择配偶和躲避捕食者方面发挥着至关重要的作用[1,2,3]。环境中的气味分子由表达于鼻腔嗅觉上皮中的嗅觉受体（ORs）检测[4,5]。完整的嗅觉受体基因编码G蛋白偶联受体（GPCRs），其特征为具有七个α螺旋跨膜结构域，形成约310个氨基酸的蛋白质。嗅觉受体基因广泛分布于脊索动物中，跨越七个演化类群，包括头索动物、无颌鱼、有颌鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物，最早于1991年在啮齿类动物中被鉴定。每个嗅觉受体基因编码一种受体蛋白，使动物能够区分各种各样的化合物。一种气味分子可被多种嗅觉受体识别，而一种嗅觉受体也可识别多种气味分子。不同嗅觉受体对气味分子的组合式识别最终产生独特的神经元气味编码模式，从而使识别大量环境气味成为可能[6]。基于氨基酸序列差异，嗅觉受体蛋白一般分为I类和II类，前者优先结合水溶性气味分子，后者结合疏水性气味分子[7]。

嗅觉受体基因的数量在不同哺乳动物之间存在差异，不同物种的嗅觉受体基因库差异很大，这可能部分与生态位差异有关。最显著的区别发生在陆生和海洋哺乳动物之间。例如，非洲象拥有已知最大的功能性嗅觉受体基因库，编码近2000个基因，而鲸目动物仅有几十个功能性嗅觉受体基因。在从陆地过渡到水生栖息地的过程中，海洋哺乳动物经历了大量的功能性嗅觉受体基因丢失；值得注意的是，齿鲸类还进一步演化出回声定位作为适应水生环境的替代感觉方式[8,9,10,11,12,13]。同样，作为哺乳动物，鸭嘴兽拥有约350个功能性嗅觉受体基因，远低于典型陆生哺乳动物如小鼠（约1000个）、狗（约811个）和大象（约1841个），甚至低于其单孔目近亲针鼹（约600个）[14]。这种减少的嗅觉受体基因库可能反映了与其半水生生活方式相关的从嗅觉依赖型到电感受依赖型的猎物探测方式转变。

灵长类动物在演化过程中也经历了加速的嗅觉受体基因丢失，这与两大适应性转变导致的嗅觉依赖降低有关：狭鼻类祖先获得了敏锐的视觉（包括中央凹的形成和视网膜的丢失），以及悬猴类从果实取食向叶片取食的饮食转变，后者中气味线索对食物选择的重要性较低[15,16]。人类、黑猩猩、红毛猩猩、恒河猴和狨属仅保留约300-400个功能性嗅觉受体基因，少于大多数非灵长类陆生哺乳动物[17]。

Liu等人注释了23种哺乳动物的嗅觉受体基因。陆生物种包括负鼠、非洲象、大熊猫等，而海洋哺乳动物包括弓头鲸、小须鲸、威德尔海豹等[18]。Jian等人鉴定了大熊猫和北极熊的嗅觉受体基因[19]。2023年，Zhou等对食肉目熊科六种物种——大熊猫、眼镜熊、美洲黑熊、棕熊、北极熊和亚洲黑熊进行了嗅觉受体基因注释[20]。在大熊猫这一在三项研究中均涉及的物种中，完整嗅觉受体基因数量和假基因比例存在显著差异。Liu等人报告大熊猫有611个功能性嗅觉受体基因，Jian等人记录645个完整嗅觉受体基因，而Zhou等人仅记录该物种有408个功能性嗅觉受体基因。

多项跨哺乳动物比较基因组研究已证实，水生适应导致嗅觉受体基因趋同退化[8,9,10,11,12,13]。然而，这些研究仅包含少数食肉目物种，未能系统解决食肉目内嗅觉受体基因的演化模式。现有关于熊科嗅觉受体基因的相关研究大多局限于部分类群，缺乏整个食肉目范围内的系统比较，这使得难以明确陆地饮食专化物种与海洋食肉目动物之间嗅觉受体的分歧基因组特征。

食肉目物种在栖息地和饮食策略上表现出种间分化，先前的研究已记录海洋食肉目动物中存在广泛嗅觉受体基因丢失和假基因比例升高等退行性特征。据此，本研究提出核心假设：栖息地、饮食专化程度和栖息地广度是驱动食肉目嗅觉受体基因家族分歧演化的关键因素。基于此假设，我们提出以下预测：与饮食广泛和生态位广泛的通食性陆生食肉目动物相比，海洋食肉目动物和大熊猫——具有专化饮食和狭窄生态位的物种——拥有显著更少的完整功能性嗅觉受体基因和更高的假基因比例。

为实证检验这些假设和预测，我们对分类学平衡的25种食肉目基因组样本进行了注释、分析和比较，以深入了解其潜在的演化模式。

## 结果

### 食肉目动物嗅觉受体基因的总体鉴定

基于蛋白序列相似性和同源性，我们共从25种食肉目哺乳动物的全基因组序列中鉴定出20,685个完整嗅觉受体基因。详细结果信息见图1A和表S1。我们发现海洋食肉目动物的嗅觉受体基因数量（333-367个）显著少于其陆生近亲（702-1393个）（图1B；Mann-Whitney U检验，p < 0.0005）。同时，海洋食肉目动物的嗅觉受体假基因比例（49.31%-59.82%）显著高于陆生食肉目动物（24.15%-49.75%）（图1C；Mann-Whitney U检验，p < 0.0005）。值得注意的是，大熊猫在陆生食肉目动物中嗅觉受体基因数量最少（702个），远低于其他熊科物种（813-1276个），且其嗅觉受体假基因比例异常高（49.75%），达到与海洋食肉目动物（49.31%-59.82%）相当的水平。如图1D所示，每个基因组中嗅觉受体假基因的绝对数量与完整嗅觉受体基因数量之间无显著相关性（R2 = 0.1277；p > 0.05）。嗅觉受体假基因比例与完整嗅觉受体基因数量呈显著负相关（图1E；R2 = 0.5015；p < 0.0005）。

**图1 食肉目动物基因组中嗅觉受体基因库的比较**

（A）I类嗅觉受体基因比例（计算为完整I类基因数除以完整嗅觉受体基因总数）和假基因比例（计算为假基因数除以嗅觉受体基因总数）。

（B）海洋与陆生食肉目动物完整嗅觉受体基因数量的比较（Mann-Whitney U检验，p < 0.0005）。

（C）海洋与陆生食肉目动物嗅觉受体假基因比例的比较（Mann-Whitney U检验，p < 0.0005）。

（D）各基因组中嗅觉受体假基因绝对数量与完整嗅觉受体基因数量之间无显著相关性。

（E）嗅觉受体假基因比例与完整嗅觉受体基因数量呈显著负相关。

### 直系同源基因组（OGGs）

我们共从25种食肉目物种中鉴定出374个包含两个或更多完整嗅觉受体基因的直系同源基因组（OGGs）以及75个单拷贝基因。基于与完整嗅觉受体基因的序列相似性，所有假基因也被分配到这374个OGGs中（详见"方法"部分）。如图2A和2B所示，大多数OGGs包含相对少量的完整嗅觉受体基因和假基因。在374个OGGs中，每个OGG完整基因数的均值为54.8，中位数为28.5，而对应的假基因数均值和中位数分别为21.6和11。在所有OGGs中，完整嗅觉受体基因数量与假基因数量呈正相关（图2C；R2 = 0.886，p < 0.0005），表明完整基因更多的OGG往往也包含更多假基因。在同一OGG内，虽然嗅觉受体基因序列相对保守，但嗅觉受体基因数量在不同物种间差异很大。例如，在OGG2-1中，美洲黑熊（124个）、眼镜熊（114个）和花面小灵猫（101个）拥有大量完整嗅觉受体基因，而环斑海豹（16个）、港海豹（13个）和白令海豹（14个）仅有少量完整嗅觉受体基因。

**图2 OGGs内基因数量的比较**

（A）OGGs内完整嗅觉受体基因的分布。

（B）OGGs内嗅觉受体假基因的分布。

（C）各OGGs中完整嗅觉受体基因数量与嗅觉受体假基因数量的正相关关系。

（D）各物种OGGs数量的分布（上图）及最大的20个OGGs的基因标识（下图）。

如图2D所示，我们比较了25种食肉目物种的OGGs数量。OGGs数量在不同物种间差异很大，范围从194到333个。海洋食肉目动物（190-200个）显著少于陆生食肉目动物（259-333个）（Mann-Whitney U检验，p < 0.005）。在陆生食肉目动物中，大熊猫的OGGs数量最少（259个）。聚焦于最大的20个OGGs，我们观察到广泛的物种特异性基因重复。例如，在花面小灵猫中，OGG2-1、OGG2-2和OGG2-6各包含超过30个成员，而在亚洲黑熊中，OGG2-1和OGG2-6也各有超过30个成员（图2D）。

### 选择压力

所有25种食肉目物种的ω值均低于1，表明嗅觉受体基因功能处于净化选择之下。在I类基因与II类基因ω值的比较中，前者显著低于后者（图3B；p < 0.0005），表明II类基因演化更为活跃。如图3C所示，包含海洋食肉目动物基因的OGGs表现出显著高于陆生食肉目动物的ω值，表明海洋食肉目动物的净化选择更为松弛。在陆生食肉目动物中，大熊猫的ω值最高（0.3）。大多数OGGs的ω值范围为0.2至0.4（图3D）。

**图3 嗅觉受体基因选择压力的比较分析**

（A）25种食肉目物种OGGs的ω值估计。

（B）箱线图比较I类与II类OGGs的ω值（Mann-Whitney U检验，p < 0.0005）。

（C）箱线图比较海洋与陆生食肉目动物OGGs的ω值（Mann-Whitney U检验，p < 0.0005）。

（D）各OGGs中ω值估计的分布。

### 嗅觉受体基因的获得与丢失

根据定义，单个OGG内的所有基因假定源自一个最近的共同祖先基因（MRCA）。然而，直系同源推断存在固有的不确定性，源于基因组组装不完整、嗅觉受体序列片段化以及聚类算法的局限性。因此，我们分析中恢复的374个OGGs代表的是计算估计的祖先基因库，而非食肉目共同祖先中真实完整嗅觉受体基因的确切数量。由于基因的获得和丢失，这些基因在不同物种间表现出变异。在海洋哺乳动物及其密切相关的陆生近亲的演化过程中，我们估计了374个嗅觉受体基因沿每个分支的OGG获得和丢失速率。不同谱系中均发生了广泛的基因获得和丢失（图4）。因此，即使两个物种的OGGs或基因数量相似，其嗅觉受体基因库也可能存在显著差异。例如，北象海豹和北方毛皮海豹各有194个OGGs，但两者之间仅共享162个OGGs。此外，25种哺乳动物物种中的每一种都丢失了数十个到一百多个存在于MRCA中的完整嗅觉受体基因。

值得注意的是，海洋食肉动物丢失的祖先OGG数量（174–184个）远远多于陆生食肉动物（41–115个）（图4，Mann-Whitney U检验，p < 0.0005）。在陆生食肉动物中，大熊猫丢失的祖先OGG数量最多（115个）。

**图4 食肉目演化过程中OGG的变化及物种生态数据**

蓝色方框表示现存物种中OR基因完整的OGG数量。黄色椭圆表示推断的祖先节点处完整的OGG数量。海洋与陆生哺乳动物之间OGG丢失数量的差异以箱线图展示。

**OR基因的生态关联**

为探究三种生态性状——栖息地、食性和栖息地广度——对食肉目功能OR基因拷贝数、假基因比例及进化选择压力（ω）的调控效应，我们构建了分布适应的广义线性模型（GLMs），并通过偏差减少量量化了每个预测变量的独立解释力。

对于完整功能OR基因的数目，采用对数链接函数的负二项GLM展现出稳健的整体拟合效果（零偏差 = 155.79，残差偏差 = 24.73，AIC = 320.28）。陆生和广食性物种拥有显著更多的完整OR基因（陆生：β = 0.581，p = 0.00195，平均数量是水生物种的1.79倍；广食性食性：β = 0.434，p = 0.01686，平均数量是狭食性物种的1.54倍），而栖息地广度无显著效应（p > 0.05）。偏差分解将栖息地类型确定为拷贝数变异的主要预测因子，解释力排序为：栖息地 > 食性 > 栖息地广度（图5A）。

**图5 柱状图展示广义线性模型推导的偏差减少值，反映三种生态因素（栖息地、食性和栖息地广度）对哺乳动物物种嗅觉受体进化关键表型的解释力**

（A）完整OR基因总数。（B）OR假基因比例。（C）由OR同源基因簇计算的平均ω（dN/dS）值。

对于OR假基因比例，二项logit GLM表现出强劲的模型性能（零偏差 = 1155.82，残差偏差 = 415.55，AIC = 609.67）。广食性物种的假基因比例显著较低（β = ?0.794，p < 2 × 10?1?，相对于狭食性物种其比值比仅为45.2%），栖息地广度与假基因比例呈显著正相关（β = 0.020，p = 0.0257），而栖息地类型无可检测的影响。食性类型贡献了远大于其他两个预测因子的独立解释力（图5B）。

对于OR基因的进化选择压力ω，高斯GLM显示仅食性类型具有边缘显著效应（β = ?0.0311，p = 0.0577）：广食性物种的ω值较低，表明存在更强的净化选择。栖息地类型和栖息地广度均未显著预测ω。偏差分解确认食性类型是驱动ω分歧的主导因素（图5C）。

**讨论**

OR基因家族是哺乳动物中最大的基因家族之一，不同谱系间OR基因的数量和功能状态差异显著，通常与物种特异的生态适应密切相关。在本研究中，我们系统鉴定并比较了25种食肉动物（包括海洋和陆生物种）的OR基因，以探究不同生态背景下嗅觉系统的进化模式及其潜在驱动因素。嗅觉受体基因库比较分析中的一个潜在问题是跨物种基因注释的准确性。本研究采用Genome2OR流程鉴定OR基因，该方法已被证明相较于Niimura广泛使用的方法具有更好的注释性能。与人工校对的HORDE数据库的比较进一步支持了我们注释的可靠性，Genome2OR鉴定的OR序列中有92.3%–99.4%在各物种间成功比对。尽管基因组组装质量的差异可能仍在一定程度上影响假基因检测，但这些结果表明，本文分析的OR基因库具有稳健的注释质量，适用于比较进化分析。

已有独立注释研究报道了大熊猫完整功能OR基因数目的显著数值差异，这源于两个核心异质性因素：不同的基因组组装版本和不一致的OR鉴定流程。Jian等人使用早期碎片化支架级别的大熊猫基因组和内部ORFAM流程（采用宽松序列筛选标准），鉴定出645个完整OR，保留了大量边缘候选序列。Liu等人基于低连续性基因组组装，通过简单的tBLASTn同源搜索（无多层结构验证），回收了611个功能OR。相比之下，Zhou等人采用了高质量染色体级别的基因组数据，并整合了tBLASTn比对、Solar片段组装、GeneWise基因预测和HMMER保守结构域筛选的多步骤工作流程；其严格筛选标准仅产生408个完整OR基因。在本研究中，我们实施Genome2or注释流程，为大熊猫注释了702个功能完整OR。我们工作中回收的较大量数可归因于更新的基因组组装资源、标准化的全长OR预测算法，以及与前述三项研究相比在敏感性和特异性之间取得平衡的优化截断参数。

我们发现海洋食肉动物的OR基因数量显著少于陆生食肉动物，且OR假基因比例明显更高。这一结果与之前关于鲸类和鳍足类嗅觉退化的研究一致，表明水生环境中对嗅觉的依赖减少导致了OR基因库的功能丧失。值得注意的是，OR基因家族高度动态的进化历史似乎独立于基因组组织方式，更可能受物种特异的生态位影响。

一项对23种哺乳动物的先前研究揭示了海洋与陆生哺乳动物之间OR基因库的差异。尽管该研究包含了大熊猫——这是其数据集与我们的数据集中唯一共享的物种——但未报告OR基因退化的证据。相比之下，本研究聚焦于食肉目物种，发现大熊猫在本研究陆生食肉动物中OR基因数量最低，而其假基因比例异常高，达到海洋食肉动物的水平。这一现象提示大熊猫的嗅觉系统可能经历了类似的退化过程，其驱动因素并非水生环境，而是其高度特化的食性（几乎完全依赖竹子）及其森林竹林栖息地。类似地，灵长类一般拥有更少的OR基因，可能因为它们更依赖视觉而非嗅觉。在非人灵长类中，叶食性与功能OR基因数目呈显著负相关。主要依赖视觉的鸟类通常较少受嗅觉线索影响，其完整OR基因数量明显少于大多数哺乳动物。

OGG分析表明，所考察的25种食肉动物中约有374个祖先OR基因为共享，凸显了这一基因家族的保守性。然而，哺乳动物之间OR基因库大小存在巨大差异，这主要由少数大型OGG的谱系特异性扩增驱动（如OGG2-1），可能与独特的生态适应有关。此外，这些新基因的固定或丢失可能反映了哺乳动物对其生态位的适应。深海潜水鲸类丢失了大量OR基因，仅保留数十个，而陆生哺乳动物携带的OR基因数量约为水生谱系的三倍。这种差异源于两种互补的进化力量：陆生类群的基因重复驱动扩增和水生类群的广泛基因丢失。尽管共享祖先核心，物种间在OGG数量和基因组成方面均检测到显著差异。例如，花面狸在某些OGG内表现出大规模基因扩增，而海洋食肉动物和大熊猫则显示OGG数量减少和广泛基因丢失。这些结果表明，OR基因家族的进化不仅受大规模基因丢失影响，还受物种特异性重复事件塑造。这种"保守核心加谱系特异性分化"的模式与其他大型多基因家族的发现一致，如Zhang记录的胰腺核糖核酸酶（RNASE A）超家族。在叶食性长臂猿中，一组古老的功能必需RNase旁系同源物构成保守核心，而亚洲和非洲长臂猿各自独立发生RNASE1的谱系特异性重复，通过平行氨基酸替换适应叶食性饮食。遵循相同进化范式的其他哺乳动物基因家族包括视觉视蛋白、苦味受体（TAS2R）基因和主要组织相容性复合体（MHC）基因，它们均保留了深度保守的核心结构域，同时经历由生态适应驱动的类群特异性拷贝数扩增或收缩。海洋食肉动物OR基因的趋同丢失可能反映了其独特的水生感觉系统，其中大多数OR基因处于放松或不存在的选择约束下。同样，在大熊猫中，大量OR基因丢失可由其"竹林"环境中气味线索多样性降低来解释，这削弱了维持大量OR基因库的进化优势。

已有充分证据表明，所有食肉动物中完整的OR基因普遍受净化选择支配，这由所有谱系范围ω值均低于1的观察所支持，意味着有害的氨基酸改变突变在进化过程中仍被优先消除。然而，净化选择的强度在不同生态群体间差异显著，导致不同选择放松程度。基于似然度的ω分析揭示II类OR基因的ω值显著高于I类，表明受较弱基线净化约束驱动，具有更动态的进化轨迹，这可能对应于其检测复杂多变环境气味物的核心功能。更重要的是，海洋食肉动物和大熊猫的同源基因组（OGGs）相较于其他陆生食肉动物持续显示升高的ω值，表明这两个谱系内净化选择的明显放松。这一模式反映了嗅觉功能约束的趋同衰减，而非选择性限制的完全丧失：温和的净化选择仍在运作以保留部分受体功能，但对抗破坏性突变的选择强度大幅降低。这种放松的约束加速了功能丧失变异的积累和假基因化，与水生栖息地或高度特化的竹食生态位下对嗅觉线索依赖减少的情况一致。

系统发育重建表明，食肉动物共同祖先拥有更大数量的完整OR基因库，而每个现存物种已独立丢失了数十至一百多个祖先OR基因。海洋谱系的基因丢失程度显著大于陆生谱系，大熊猫在陆生食肉动物中表现出最高水平的基因丢失。这些发现表明基因丢失是嗅觉系统退化的主要机制，而谱系特异性基因扩增则在某些物种中维持了嗅觉多样性和功能需求。

我们对25种食肉动物OR基因库的比较基因组分析揭示了由栖息地和饮食生态位塑造的分歧进化轨迹：水生鳍足类谱系表现出功能OR基因的严重收缩、假基因化升高和净化选择放松，而陆生食肉动物通过反复的谱系特异性重复维持了较大的完整OR池，竹食特化的大熊猫则展现出区别于其他杂食性熊科动物的独特中间退化模式。这些发现与一系列聚焦生态适应的哺乳动物比较OR研究一致。Zhou等人系统描绘了六种熊科物种的OR基因组成，证明专性植食性大熊猫拥有更高的假基因比率，并丢失了在杂食性熊科物种中保守的数种植物气味感知OR亚家族，与我们关于竹食食肉动物嗅觉功能约束减弱的观察一致。三个独立海洋哺乳动物类群（鲸类、鳍足类、海牛类）的平行趋同OR退化已反复得到验证；Liu等人量化了水生哺乳动物相较于陆生对应物种的OR获得率大幅降低和基因丢失率大幅升高，并进一步确认在频繁生灭周转下的OR同源基因组倾向于在较弱的净化选择下进化，与我们跨陆生和水生食肉动物的基于ω的选择压力结果吻合。在食肉目之外，大规模哺乳动物OR调查建立了普遍的生态位相关分化：植食性哺乳动物经历OR 5/8/9亚家族的大规模扩增，与植物挥发物检测相关；独居陆生物种累积了比社会性物种更多的物种特异性OR重复；而完全水生哺乳动物无论系统发育起源如何均趋同于缩小的功能基因库。这种栖息地和食性依赖的化学感觉基因家族重塑并非哺乳动物所独有。

在昆虫中，嗅觉受体（OR）库的趋异扩张与收缩紧密追踪宿主范围、摄食习性和昼夜活动规律；植食性昆虫进化出扩增的 OR 分支以感知植物挥发物，而特化的寄生类群则经历广泛的 OR 假基因化，这反映了共同的进化逻辑：化学感觉基因周转适应于生态感官需求，即使是在 OR 蛋白架构结构不同的门之间亦是如此。这些结果表明，大熊猫 OR 基因的减少可能与某些生态因素有关：1) 大熊猫栖息在几乎完全被竹子覆盖的栖息地，多样化的环境气味对生存不那么关键，削弱了维持完整嗅觉敏感性的净化选择；2) 它们几乎专一的食竹习性创造了稳定、单一的食物资源，进一步降低了对广谱气味检测的生态需求，减轻了针对 OR 序列破坏性突变的选择不利压力，并加速了假基因化。

**研究局限性**

尽管我们的比较基因组学分析揭示了食肉目动物生态适应与嗅觉受体（OR）库进化之间的清晰联系，但本研究存在一些固有局限性。首先，我们的分类单元采样包括 25 个食肉目物种。尽管该数据集涵盖了主要的食肉目谱系和代表性生态型，但从其他分类单元扩展采样可能有助于进一步细化我们识别出的生态关联。其次，我们基于可用的基因组组装注释了完整的 OR 基因和假基因，组装质量和基因预测伪影可能会影响 OR 库大小的估算。最后，我们的比较分析侧重于基因数量变化，而非单个 OR 蛋白的功能表征，因此我们无法直接将基因库的变化与这些食肉目动物真实的嗅觉感知差异联系起来。未来的功能测定和扩展的分类单元采样将补充这些基因组学观察结果。

**资源可用性**

**主要联系人**
更多信息和资源请求应提交给并将由主要联系人康立文（[e-mail]）处理。

**材料可用性**
本研究未产生材料。

**数据与代码可用性**
* **数据：** 25 个食肉目物种的注释嗅觉受体序列见表 S4。
* **代码：** 本文未报告原始代码。
* **附加信息：** 重新分析本文中报告的数据所需的任何其他附加信息，均可在向主要联系人提出请求并获得其批准后获取。

**致谢**
本研究得到国家自然科学基金（批准号 32470516 和 31900337）、国家林业局大熊猫国际合作基金会（2023 年）以及国家重点研发计划（批准号 2023YFF1305400）的支持。我们还要感谢匿名审稿人提出的建设性意见。

**作者贡献**
L.K.：构思、方法论、调查、软件、资源、正式分析和原始草稿撰写。J.C.、M.H. 和 W.W.：调查、验证和数据整理。Z.X. 和 Z.Z.：构思、监督、资金支持、原始草稿撰写以及审阅和编辑。

**利益声明**
作者声明无竞争利益。

**方法**

**关键资源表**

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
| :--- | :--- | :--- |
| 25 个食肉目参考基因组组装 | NCBI RefSeq | 见表 S1；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ |
| Mammalia BUSCO v5.4.3 数据集 | 本文 | 见表 S2 |
| 食肉目生态性状数据集 | Ding et al. | 见表 S3 |
| **软件和算法** | | |
| Genome2OR 流程（OR 基因注释） | Han et al. | https://doi.org/10.1007/s11427-021-2081-6. |
| MAFFT（多序列比对，E-INS-i） | Katoh & Standley | https://doi.org/10.1093/molbev/mst010. |
| MEGA 6（系统发育重建，NJ 树） | Liu et al. | https://doi.org/10.1186/s12864-019-6290-0. |
| OrthoFinder（直系同源组推断 v2.5.4） | Emms & Kelly | https://doi.org/10.1186/s13059-019-1832-y. |
| PAML 4.9（codeml M0 单比率模型，ω 计算） | Yang | https://doi.org/10.1093/molbev/msm088 |
| R v4.5.0（统计分析，GLM，相关性检验） | R Core Team | RRID:SCR_001905 |
| GraphPad Prism v8.0（绘图可视化） | GraphPad Software | RRID:SCR_002798 |
| BUSCO v5.4.3（基因组组装完整性评估） | BUSCO Software | RRID:SCR_015008 |

*在新标签页中打开表格*

**方法细节**

**基因组数据**
在本研究中，我们基于三个标准筛选并注释了 25 个代表性食肉目物种的 OR 基因：
(1) 全面的分类覆盖，涵盖九个食肉目科，即猫科（Felidae）、灵猫科（Viverridae）、獴科（Herpestidae）、犬科（Canidae）、熊科（Ursidae）、小熊猫科（Ailuridae）、海豹科（Phocidae）、海狮科（Otariidae）和鼬科（Mustelidae）；
(2) 分层的生态梯度，包括 20 个具有不同饮食制度的陆生物种（如杂食性、专性肉食性和食竹特化的大熊猫），以及 5 个具有独立进化起源的全水生鳍足类物种；
(3) 基因组质量控制标准：仅选择沉积在 NCBI 数据库中的、具有高组装质量的公开发布的染色体级或支架级参考基因组，以确保嗅觉受体基因注释结果的可靠性。
物种完整列表如下：猎豹、虎、雪豹、大灵猫、马来灵猫、侏儒獴、郊狼、赤狐、大熊猫、马来熊、棕熊、亚洲黑熊、美洲黑熊、北极熊、眼镜熊、小熊猫、环斑海豹、港海豹、斑海豹、北毛皮海豹、斯特勒海狮、欧亚水獭、獾、狼獾、黄喉貂（表 S1）。
使用 BUSCO v5.4.3 和包含 14,502 个保守哺乳动物单拷贝标记基因的 mammalia_odb10 数据集评估了所有 25 个食肉目基因组的组装完整性。表 S2 汇总了每个组装体中完整单拷贝基因、完整重复基因、碎片基因和缺失基因的比例。

**OR 基因鉴定**
使用 Genome2OR 流程从基因组组装中鉴定 OR 基因。Genome2OR 是一个从脊索动物基因组组装中注释嗅觉受体基因的自动化流程，包含五个集成模块：nhmmer.py、FindOR.py、IdentifyFunc.py、Batch.py 和 Iteration.py。
注释过程从 nhmmer.py 开始，该模块使用支系特异性 DNA profile 隐马尔可夫模型扫描基因组中的 OR 位点。这些 profile HMM 是通过在蛋白质 MSA 指导下构建 DNA 多序列比对（MSA），随后使用 hmmbuild 进行模型生成而构建的。鉴于 OR 编码序列在脊索动物进化支系间存在显著的序列分歧，分别为七个谱系生成了独立的 profile HMM：圆口类、无颌鱼类、有颌鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物。
nhmmer 的输出随后由 FindOR.py 处理以提取推定的 OR 编码序列。对于每个基因组命中，如果片段长度短于 1,200 bp，则将其扩展到最小长度，并识别所有潜在的起始和终止密码子以定义候选编码区。通过扫描起始和终止密码子之间的所有潜在开放阅读框（ORF）（在正向和反向链上均进行）进行 ORF 评估。选择最长的 ORF 作为主要候选者，并检查其长度、完整性和翻译连续性。如果最长的潜在编码区短于 750 bp、包含长度不能被三整除所指示的移码突变，或缺乏完整的终止密码子，则初步将序列分类为假基因。通过这些初始检查的序列被指定为潜在功能基因，并转发给 IdentifyFunc.py 进行结构验证。在该模块中，候选序列与模板 OR 序列合并，并使用 MAFFT 进行多序列比对，随后分割成跨膜螺旋、胞内环、胞外环和末端区域。最终分类依据四个标准：匹配保守模式少于十个、跨膜区域总氨基酸缺失超过十个、多于两个跨膜螺旋中存在缺失，或 N 端长度异常。不符合任何标准的序列基于其最长完整片段分类为假基因，而通过所有检查的序列分类为功能基因。
对于大规模应用，Batch.py 支持多个基因组的并行注释，而 Iteration.py 为非哺乳动物支系提供迭代注释。在这种迭代方法中，第一轮鉴定出的 OR 序列用于更新 profile HMM，然后应用于后续搜索轮次以捕获初始模型可能遗漏的分歧 OR 序列。最终输出包含两类：具有完整编码序列、完整开放阅读框和保守结构特征的功能基因；以及包含移码突变、提前终止密码子或严重结构破坏的假基因。
与 Niimura（2013）描述的 OR 基因鉴定方法相比，Genome2OR 的性能得到了显著改善。人类嗅觉数据浏览器（HORDE）提供了最先进的 OR 基因注释，Genome2OR 获得的结果与 HORDE 高度一致。具体而言，Genome2OR 在每个物种中鉴定的 OR 序列的 92.3%–99.4% 可以映射到 HORDE。值得注意的是，对于所有分析的物种，Genome2OR 的准确性始终优于 Niimura 提出的方法。

**系统发育树构建**
使用 MAFFT 中实现的 E-INS-i 算法以默认参数对齐蛋白质序列。使用 MEGA 6 中的邻接法（NJ）和 Poisson 距离构建系统发育树。

**直系同源基因簇分配**
我们使用 OrthoFinder 对所有鉴定的完整 OR 基因进行分类，并获得了 360 个直系同源基因簇（OGG）。OGG 指的是源自焦点物种共同祖先共享的单个祖先 OR 基因的所有后代基因。在哺乳动物进化过程中，谱系只能完全丢失一个祖先 OGG；基因重复仅能在现有 OGG 内生成额外的基因拷贝，而不能创造全新的 OGG 类别。这些初始的 360 个 OGG 每个至少包含两个基因成员。其余 103 个单基因通过系统发育树分析进一步排序。具体而言，我们构建了一棵包含所有 103 个单基因 OR 序列和非 OR GPCR 基因的系统发育树，其中非 OR GPCR 被设为外群。与自群支持率 >70 的单系支内的基因被分配为同一个 OGG，而未聚类的孤立基因则保持为唯一的单基因。经过这次二次聚类，103 个单基因被分为另外 89 个 OGG。
在检查的 25 个食肉目物种中，所有 20,685 个完整 OR 基因最终被分类为 374 个 OGG 和 75 个单基因。374 个 OGG 每个包含两个或更多完整 OR 拷贝，而每个单基因在所有采样物种中仅由一个完整基因代表。我们标准化了所有 OGG 的命名方案：由 I 类 OR 衍生的簇前缀为 OGG1，而 II 类 OR 簇前缀为 OGG2，随后是根据每个 OGG 内完整基因拷贝总数排序的顺序数字标签。

**选择压力分析**
我们使用 PAML 4.9 中的 codeml M0 单比率模型计算每个直系同源基因簇的全局 ω（dN/dS，非同义替换与同义替换速率比；该指标量化作用于基因的功能约束强度，较高的 ω 值表示较弱的功能约束）值。我们将分析限制在包含至少三个序列的 OGG 中。本研究中未应用位点模型、分支模型或分支 - 位点模型。选择 M0 单比率模型是因为它生成单个平均 ω 值，代表每个直系同源簇整个基因树的总体进化约束，这符合我们比较数百个 OR 基因簇平均选择压力的核心目标。

**食肉目生态因素比较**
为了探索 OR 基因与生态适应之间的潜在联系，我们根据三个生态因素对物种进行分类：饮食（肉食性、食鱼性、草食性或杂食性）、栖息地（陆地或海洋）和栖息地广度。这些类别反映了多样化的生态策略和环境条件。物种分配基于已发表的数据（图 5 和表 S3）。

**量化与统计分析**
为了评估嗅觉基因库的生态差异，使用 Mann-Whitney U 检验比较海洋和陆生食肉目动物之间完整 OR 基因数量和 OR 假基因比例。在 GraphPad Prism（v8.0）中生成和可视化箱线图及热图以说明数据分布。使用 R 版本 4.5.0 中实现的皮尔逊积矩相关检验评估完整基因与假基因之间的关联。计算相关系数、p 值和 R2（决定系数）以评估两个变量之间线性关系的强度和显著性。应用广义线性模型（GLM）量化三个生态预测因子（栖息地类型、饮食类型和栖息地广度）对食肉目动物 OR 基因三个进化性状的独立影响：完整功能 OR 基因的数量、OR 假基因的比例以及进化选择压力 ω（dN/dS 比）。根据数据特征，我们为每个响应变量指定了不同的误差分布和链接函数：
对于完整 OR 基因的离散计数，构建带有对数链接函数的负二项 GLM，以解决计数数据中可能存在的轻度过度离散；分类预测因子的参考水平设置为水生栖息地和专食性饮食；
对于假基因比例（由每个物种的假基因数量和 OR 基因总数组成的二元计数数据），采用带有 logit 链接函数的二项 GLM 来建模 OR 假基因化的几率；
对于反映选择性约束的连续 ω 值，使用带有恒等链接函数的高斯 GLM。
所有三个全模型均纳入栖息地类型、饮食类型和栖息地广度作为固定预测因子。我们计算了零偏差（仅截距模型）和残差偏差（包含所有预测因子的全模型），以及赤池信息准则（AIC），以评估整体模型拟合优度。执行 Wald z-或 t 检验以评估每个回归系数的统计显著性。

为了厘清各生态预测变量的相对解释贡献，我们量化了单独移除每个变量所引起的模型偏差度减少量，并可视化偏差度减少值，以比较栖息地类型、食性类型和栖息地广度在所有三个嗅觉受体基因特征中的解释能力。补充信息 (3) 下载全部 PDF (164.18 KB) 文档 S1。表 S1 和 S2 电子表格 (12.01 KB) 表 S3。25 种食肉动物的生态数据 电子表格 (6.34 MB) 表 S4。25 种食肉目动物的嗅觉受体基因库