《Journal of Clinical Medicine》：Erythrocyte-Associated Proteins Underlie the Reported Oxidative-Stress Enrichment in Plasma Proteomics of Obstructive Sleep Apnoea: A Secondary Quality Marker Analysis of Public Datasets
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背景：释放入血浆的红细胞蛋白携带氧化相关注释，可被解读为氧化应激（oxidative stress）的证据。研究人员检验这是否适用于一项阻塞性睡眠呼吸暂停（obstructive sleep apnoea, OSA）血浆蛋白质组学研究中报道的氧化应激富集。方法
背景：释放入血浆的红细胞蛋白携带氧化相关注释，可被解读为氧化应激（oxidative stress）的证据。研究人员检验这是否适用于一项阻塞性睡眠呼吸暂停（obstructive sleep apnoea, OSA）血浆蛋白质组学研究中报道的氧化应激富集。方法：在公共数据（PXD073409；男性；15例非OSA、15例轻度OSA、15例重度OSA；422种蛋白）的二次分析中，研究人员根据Geyer等的panel计算红细胞（erythrocyte）、血小板（platelet）和凝血（coagulation）质量标志物（quality marker）指数；红细胞panel仅部分定量（29个条目中的15个）。研究人员在排除panel成员、对红细胞指数进行校正以及采用留一蛋白（leave-one-protein-out）指数的情况下，重复了原始差异分析和过表征分析（over-representation analysis）。第二套公共数据集（PXD069503；15例重度OSA、15例轻至中度OSA、15例对照）用于方向性比较。临床协变量不可获得。结果：轻度OSA（几何均数比1.74，95% CI 1.04～2.80）和重度OSA（2.43，1.68～3.47）的红细胞指数高于非OSA受试者。重度OSA中升高的13种蛋白中有6种为红细胞panel成员，所有9个富集条目均由panel成员组成，包括过氧化氢分解过程（hydrogen peroxide catabolic process）（HBA1、HBB、HBD、PRDX2）。校正后，PRDX2可由红细胞含量解释，而血红蛋白链仍升高并携带其中7个条目。仅该指数即可区分重度OSA与非OSA受试者（受试者工作特征曲线下面积[area under the receiver operating characteristic curve, AUROC] 0.858）；数据无法显示全部422种蛋白（AUROC 0.969）是否在其基础上增加判别能力（差异+0.111，95% CI ?0.009～+0.268）。在第二套数据集中，重度OSA的指数高于对照（1.55，1.06～2.35）。结论：所报道的氧化应激富集依赖于红细胞相关蛋白，并且在这些数据中并非血浆氧化活性改变的证据。该含量究竟发生于静脉穿刺前还是穿刺后无法确定。血浆蛋白质组学生物标志物结果应同时报告质量标志物指数。
研究背景：阻塞性睡眠呼吸暂停（obstructive sleep apnoea, OSA）常见且多数未诊断，诊断依赖多导睡眠监测（polysomnography, PSG），促使血液生物标志物用于筛查和刻画全身后果。血浆是生物标志物研究常用基质，质谱可定量数千种血浆蛋白，但红细胞或血小板内容物即使少量携带也会系统性改变测量蛋白质组。Geyer等建立红细胞、血小板和凝血质量标志物panel（由特定细胞来源蛋白组成的质量标志物集合），其指数与污染细胞数线性相关；在210项已发表生物标志物研究中，54%报告至少一个质量panel蛋白为候选生物标志物。Geyer等警告红细胞泄漏蛋白如血红蛋白亚基、碳酸酐酶、过氧化物还原酶2等携带氧化相关注释，可能被误读为氧化通路激活。OSA中间歇性缺氧和复氧被认为产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），氧化应激是OSA相关终末器官损伤公认组成部分，因此重度OSA蛋白质组发现氧化应激信号具有强先验合理性。原血浆蛋白质组研究报道重度OSA有氧化应激特征，其中几种蛋白是Geyer等红细胞质量标志物，但原报告未用质量标志物panel测量。研究人员因此对公共数据进行二次分析，主要目标为确定该氧化应激富集是否可归因于红细胞相关蛋白；零假设为红细胞质量标志物指数在非OSA、轻度OSA和重度OSA间无差异，且排除或校正红细胞panel蛋白后富集持续。次要目标为描述校正后剩余差异信号、比较红细胞指数单独与全蛋白质组判别、报告血小板和凝血指数；第二数据集分析为探索性。
主要关键技术与方法：该研究为公共数据二次分析。主要数据集PXD073409来自Müller等的单中心、前瞻性、观察性男性队列，蛋白质组子集45例，按PSG分为非OSA（呼吸暂停低通气指数<5，n=15）、轻度OSA（5–15，n=15）和重度OSA（>30，n=15），血浆EDTA管收集，autoSP3协议，Orbitrap Exploris 480数据非依赖采集，Spectronaut定量，保留至少70%样本检测到的422个蛋白组。第二数据集PXD069503来自Zhao等，45例发现队列，15例重度OSA、15例轻至中度OSA、15例对照，Orbitrap Fusion Lumos，无标记定量，用于方向性比较。方法包括Geyer等质量标志物panel指数、差异丰度分析、过表征分析、重复分层五折交叉验证和L2惩罚logistic回归（一种正则化广义线性分类模型）、bootstrapping置信区间、FDR控制、留一蛋白指数以及校正红细胞指数的普通最小二乘模型。临床协变量不可用。
研究结果：
3.1 质量标志物指数在临床组间存在差异：红细胞指数在轻度OSA（几何均数比1.74，95% CI 1.04–2.80）和重度OSA（2.43，1.68–3.47）高于非OSA；不同指数定义结果一致。血小板指数在OSA中较低，凝血指数无明显差异；组间均值差异呈分布式而非离群值驱动。
3.2 报告差异列表很大比例由panel成员构成：重度对非OSA检出22个差异蛋白，13个在重度OSA升高，其中6个为红细胞panel成员（CA1、HBA1、HBB、HBD、PRDX2、SLC4A1）。原报告为24个差异蛋白，差异来自年龄校正和缺失值处理，关键蛋白效应量一致。PRDX2等与红细胞指数强相关，留一蛋白去除后相关性基本不变；血红蛋白链共同贡献panel强度98%。
3.3 富集项组成：未校正差异列表返回9个q<0.25条目，均为红细胞或气体运输/血红素相关，过氧化氢分解过程由HBA1、HBB、HBD、PRDX2驱动。排除panel成员或校正后9个条目消失；使用排除三条血红蛋白链的指数校正后，HBA1、HBB、HBD仍升高，而PRDX2、CA1、SLC4A1不再显著，7/9条目再次q<0.25。
3.4 可归因于红细胞指数的判别能力：交叉验证中全422蛋白模型AUROC为0.969，红细胞指数单独为0.858，12个panel成员为0.853，排除panel后为0.956。全模型对指数单独的配对差异为+0.111，95% CI ?0.009至+0.268，包含零，数据不能显示剩余蛋白是否增加判别。
3.5 校正后保留的信号：420个测试蛋白中，16个q<0.05、84个q<0.25；加|log
2 fold change|≥0.5后为22个。限制于409个非panel蛋白并校正log
2红细胞指数后，q<0.05从11降至1，q<0.25从73降至30。主要阈值仅IGF1保留，探索阈值有A2M、SERPINC1、BCHE、CLEC3B、ALB、GC、SERPINA6等；CRP方向幅度保留；30个校正后显著蛋白中25个校正差异大于未校正差异。
3.6 敏感性分析和判别信号位置：仅用血红蛋白链计算指数，组间差异为2.52倍；非血红蛋白panel成员较弱且不显著（1.35倍）。检测阈值变化不改变结果。Out-of-fold概率随组升高，但重叠大；非OSA对全部OSA的AUROC为0.824，轻度对重度OSA不能区分（AUROC 0.400）；红细胞指数表现类似。
3.7 第二套OSA数据集中的质量标志物含量：PXD069503中红细胞指数在OSA高于对照1.57倍，重度OSA高于对照1.55倍（95% CI 1.06–2.35）。血小板指数在OSA更高，凝血指数更低，与主数据集方向不同。血小板panel成员占差异列表顶部；校正血小板指数后仍有117个蛋白q<0.05。主数据集校正后26个蛋白中25个在此定量，重度对对照20个方向一致，8个独立显著一致，CD99和C8B相反。
讨论总结：研究人员认为，红细胞相关蛋白含量在OSA中更高；重度OSA升高的13个蛋白中6个属红细胞panel；未校正富集的所有通路条目仅由panel成员组成；PRDX2可由红细胞含量解释，而血红蛋白链校正后仍升高；红细胞指数单独AUROC为0.858。过氧化氢分解过程虽在间歇性缺氧队列中预期出现，但其贡献蛋白为血红蛋白链和PRDX2，这些注释适合红细胞内功能，不表明血浆氧化活性改变。数据不能区分分析前红细胞携带和体内红细胞相关信号；Hp总体无耗尽，但重度OSA内呈负相关，HPR和sCD163方向提示体内血红蛋白处理；EDTA血浆可能影响。第二数据集方向一致但细胞来源不同，支持报告三个指数。校正后持续蛋白非红细胞相关，IGF1等与肝合成和肥胖混杂有关，视为假设生成。小队列AUROC需谨慎，外部验证仍必要。局限包括来源不能确定、血红蛋白链主导差异、蛋白质组深度有限、部分panel未定量、轻/重度不能分、小单中心男性队列、临床协变量缺失、置信区间偏乐观、第二数据集设计差异等。
研究结论：在一套来自有或无OSA男性的公共血浆蛋白质组数据集中，红细胞相关蛋白含量在OSA中更高，重度OSA所报道的氧化应激富集完全由红细胞质量panel蛋白组成。PRDX2随红细胞含量变化，校正后保留的条目仅依赖血红蛋白链，因此在这些数据中该富集不是血浆氧化活性改变的证据。部分差异信号在校正后持续存在，并且在第二套数据集中，OSA的红细胞相关和血小板相关含量也更高。红细胞相关含量发生于静脉穿刺前还是穿刺后无法确定，且分析未对临床协变量进行校正。血浆蛋白质组学生物标志物研究应与其差异结果一起报告红细胞、血小板和凝血质量标志物指数。
