基于断点序列识别的CRISPR-PspCas13b可编程选择性沉默致癌融合转录本

《SCIENCE ADVANCES》：Programmable and selective silencing of oncogenic fusion transcripts by CRISPR-Cas13b via breakpoint sequence recognition

致癌基因融合是癌症的关键驱动因素，但大多数仍无法被当前疗法成药。在此，研究人员将CRISPR-PspCas13b（一种RNA引导的CRISPR-Cas13b核酸酶系统）确立为可个性化平台，用于系统沉默多种融合转录本。研究人员揭示，PspCas13b对断点序列的识别和切割破坏融合转录本，导致有效的蛋白质耗竭。PspCas13b切割产生异常的、翻译无能的靶RNA种类，其中一部分在切割位点近端携带内部缺失。研究人员证明，靶向BCR::ABL1断点序列可有效降解野生型（WT）和耐药BCR::ABL1突变体，而这些突变体是慢性髓性白血病（CML）中酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药和复发的主要驱动因素。分子谱分析揭示，PspCas13b损害BCR::ABL1酪氨酸磷酸激酶活性，并触发广泛的转录组和蛋白质组重塑，导致耐药细胞发生红系分化和凋亡。除BCR::ABL1外，PspCas13b的个性化设计有效沉默其他不可成药的致癌融合。总之，该研究为精准靶向不可成药或耐药致癌转录本建立了分子框架。

论文解读：基于断点序列识别的CRISPR-PspCas13b可编程选择性沉默致癌融合转录本

研究背景与问题：二代测序可在可操作时间窗内快速识别患者致癌转录本。染色体易位产生的融合基因约见于20%人类癌症，约16.5%癌症病例中融合事件作为真正致癌驱动因素。慢性髓性白血病（CML）中BCR::ABL1几乎100%存在，Ewing肉瘤中EWSR1-FLI1超过85%。融合驱动肿瘤通常肿瘤突变负荷低，融合基因为主要驱动。然而多数融合无法成药，蛋白层面结构复杂，小分子抑制剂少且易耐药复发；抑制激酶结构域不足以完全抑制致癌活性，支架功能也可驱动肿瘤发生，因此靶向蛋白或RNA降解策略可能更优。融合位点嵌合mRNA序列是序列特异性沉默的可靶向目标。RNA干扰（RNAi）特异性受短种子序列限制。VI型CRISPR效应器Cas13是可编程RNA引导核酸酶，高效降解单链RNA，且RNA靶向具有瞬时性，不永久改变基因组。PspCas13b具有高沉默效率和特异性。因此研究人员开展本研究，论文发表于《SCIENCE ADVANCES》。

研究人员开展的研究、结论与意义：研究人员将PspCas13b作为可个性化平台，通过靶向断点序列系统沉默多种致癌融合转录本，重点研究BCR::ABL1及耐药突变，并在多种融合和细胞模型中验证。结论是PspCas13b可选择性沉默融合转录本，克服TKI耐药，诱导转录组和蛋白质组重塑、红系分化和凋亡。意义是为靶向不可成药或耐药致癌RNA提供分子框架。

关键技术方法：研究人员个性化设计靶向融合断点的CRISPR RNA（crRNA），用内部核糖体进入位点（IRES）-增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告系统结合荧光显微镜、逆转录定量PCR（RT-qPCR）和Western blot评估沉默；采用短读长RNA测序（RNA-seq）、Oxford Nanopore长读长直接RNA测序（ONT-dRNA-seq）和质谱蛋白质组学分析转录组与蛋白质组；在患者来源K562细胞（成人CML急变期来源）及dasatinib诱导的TKI耐药K562（持续递增dasatinib >90天并维持200 nM，Sanger确认T³¹⁵I）中序贯核转染递送PspCas13b和crRNA；在Rh30横纹肌肉瘤细胞建立RfxCas13d稳定模型；在ES8 Ewing肉瘤细胞评估内源EWSR1::FLI1。

研究结果：
个性化设计PspCas13b高效沉默致癌融合：针对BCR::ABL1-p190、BCR::ABL1-p210、SFPQ::ABL1、SNX2::ABL1断点设计3 nt间隔crRNA，在人胚肾（HEK）293T细胞中经荧光、RT-qPCR和Western blot显示约80%至90%沉默，并抑制STAT5和ERK磷酸化。
断点识别实现融合转录本精准选择性沉默：错配分析显示≤3 nt错配耐受，≥4个非连续错配显著降低；三色荧光报告证明靶向BCR::ABL1断点的crRNA不影响未易位的野生型（WT）BCR和ABL1（15 nt错配）。
PspCas13b具有高特异性：靶向激活未切割28S RNA，RfxCas13d有部分旁切；RNA-seq未显示显著内源转录本脱靶或旁切下调；在K562中沉默eGFP非靶标仅有限影响两个内源蛋白。
Cas13切割产生异常翻译无能靶RNA同工型：短读长RNA-seq显示整体BCR::ABL1 mRNA不降，而切割位点近端约500 nt区域减少，RT-qPCR仅切割位点两侧引物显示敲低；Sashimi显示内部缺失异常异构体。ONT-dRNA-seq显示多聚腺苷酸化BCR-ABL1 reads减少约90%，残余异常转录本约12.5%，内部缺失约30至8000 nt（中位约1.16 kb），三分之二为框外。RfxCas13d靶向PAX3::FOXO1也产生异常异构体。
患者来源癌细胞中BCR::ABL1 RNA强效沉默：K562表达p210，核转染递送后RT-qPCR、Western blot和流式细胞术（FACS）显示特异沉默BCR::ABL1，不影响WT BCR/ABL1，抑制STAT5/ERK并抑制增殖，效果与imatinib类似。
BCR::ABL1 RNA切割克服继发突变驱动的TKI耐药：T³¹⁵I位于断点外，imatinib无效，而PspCas13b多个crRNA抑制WT和T³¹⁵I蛋白及下游信号；在dasatinib诱导的TKI耐药K562中，PspCas13b抑制全局酪氨酸磷酸化、CRLK、STAT5和ERK磷酸化，抑制增殖并促进凋亡。
BCR::ABL1 RNA沉默后深度转录组和蛋白质组重塑：RNA-seq和质谱显示PspCas13b在亲本和耐药细胞中引起与imatinib在亲本细胞相似的变化，但imatinib对耐药细胞影响很小；上调血红素/血红蛋白、红系、线粒体和细胞死亡正调控相关基因，下调脂代谢、糖酵解和信号基因；流式显示CD71⁺/CD235a⁺增加，p190救援实验证实为on-target效应。
有效沉默新发耐药突变：asciminib耐药C⁴⁶⁴W和T³¹⁵I-C⁴⁶⁴W突变被PspCas13b有效沉默，而asciminib不能抑制。
通过断点序列识别个性化沉默多种融合转录本：针对RUNX1::RUNX1T1、NPM::ALK、SS18::SSX1/2和EWSR1::FLI1设计crRNA，在HEK 293T和ES8 Ewing肉瘤细胞中实现有效沉默。

讨论与结论：讨论指出已描述超过3297种融合转录本，多数不可成药；本研究以BCR::ABL1为基准证明PspCas13b可沉默9种融合。PspCas13b不引起显著旁切，比TKI更特异，避免抑制正常ABL1。切割模式表明近切割位点优先降解，远端相对稳定，RT-qPCR引物应靠近切割位点；长读长显示异常内部缺失RNA，可能由切割后RNA连接产生，但具体机制尚需研究。PspCas13b可克服T³¹⁵I和C⁴⁶⁴W耐药，并容忍3至4 nt错配。转录组和蛋白质组显示亲本与耐药细胞中均可抑制致癌网络并诱导红系分化和凋亡，而imatinib对耐药细胞无效。该平台可个性化沉默多种不可成药融合。结论翻译：总之，研究人员在此描述的PspCas13b设计灵活性、功效和特异性提供了一个新的概念框架，该框架可通过靶向不可成药或耐药致癌RNA（包括融合转录本）来改变个性化医学的格局。