## 化学遗传学CRISPR筛选揭示泛素E1抑制剂TAK-243调控HAPSTR1/HUWE1轴在染色质蛋白质稳态与细胞周期控制中的作用

《SCIENCE ADVANCES》：Chemogenetic ubiquitin E1 inhibitor TAK-243 CRISPR screen uncovers HAPSTR1/HUWE1 axis in chromatin proteostasis and cell cycle control

在本研究中，研究人员试图全面绘制处于细胞增殖与蛋白质稳态交叉点的泛素信号网络，这两者在癌症中均至关重要。在泛素E1抑制剂TAK-243存在下进行全基因组CRISPR敲除筛选，鉴定出239个基因，其缺失使细胞对泛素化阻断敏感。后续研究揭示了核蛋白C16orf72/HECT、UBA和WWE结构域包含的E3泛素蛋白连接酶1（HUWE1）相关蛋白修饰应激反应（HAPSTR1）在染色质蛋白质稳态和DNA复制中的作用。研究人员证明，HAPSTR1将E3连接酶HUWE1招募至染色质，维持染色质相关蛋白质组的平衡，并且自身在细胞周期进程中被HUWE1周转。HAPSTR1/HUWE1复合物的结构建模，并经突变分析支持，表明失去HUWE1结合使得HAPSTR1在泛素信号被抑制时无法支持细胞增殖。因此，HAPSTR1缺失损害染色质相关蛋白的清除，触发全局转录和蛋白质稳态适应。在泛素信号减弱的情况下，这些适应机制让位于复制应激和过早的S期进入，最终导致细胞周期崩溃和DNA损伤。研究人员的发现揭示了与泛素信号阻断呈现合成致死的蛋白质网络，并强调了活跃增殖细胞对染色质蛋白质稳态失衡的脆弱性。

**研究背景与目的**
细胞增殖依赖于细胞周期的精确调控，而泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）通过翻译后修饰动态控制蛋白质的稳定性、定位和活性，在细胞周期检查点维持和基因组稳定性中发挥关键作用。然而，在全球范围内，泛素信号如何与调控细胞增殖的蛋白网络相互交织仍不清楚。为此，研究人员利用首类泛素E1抑制剂TAK-243作为工具药，结合全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选，系统鉴定了在泛素信号阻断条件下细胞增殖所必需的基因和通路，以期揭示泛素化与增殖调控之间的深层联系。

**研究内容与意义**
通过筛选，研究人员在RPE1-p53^?/?细胞中鉴定出239个基因缺失可致敏细胞对TAK-243的反应，55个基因缺失则赋予抗性。其中，编码核蛋白HAPSTR1及其互作E3连接酶HUWE1的基因被强烈选中。后续机制研究揭示了HAPSTR1/HUWE1轴在染色质蛋白质稳态和细胞周期控制中的新功能：HAPSTR1将HUWE1招募至染色质，维持染色质相关蛋白组的平衡，并在细胞周期进程中被HUWE1降解。该研究不仅提供了泛素信号与增殖相互作用的资源图谱，还提示了癌症治疗中利用合成致死的潜在靶点，例如HAPSTR1缺失与UPS抑制的协同杀伤作用。

**主要技术方法**
研究人员采用了多项前沿技术。首先，他们利用TKOv3慢病毒文库（约7.1万条sgRNA，覆盖18,053个基因）在RPE1-p53^?/?细胞中进行了化学遗传学CRISPR筛选，TAK-243浓度从0.1 μM逐步升至0.4 μM，持续12个群体倍增。其次，结合AlphaFold3结构建模与点突变验证，解析HAPSTR1/HUWE1结合界面。此外，运用染色质分级分离与质谱分析、UbiSite技术（内源性泛素化组）、RNA测序、DNA纤维实验、流式细胞术及活细胞成像等方法。样本来源为RPE1-p53^?/?、U2OS和HeLa等细胞系。

**研究结果**
**1. Regulators of ubiquitin signaling are important for cell proliferation**
通过全基因组筛选，研究人员发现ABCG2转运体为最高合成致死基因，其功能是介导TAK-243外排。STRING网络分析确定了221个致敏基因和37个抗性基因的核心网络，功能富集于基因表达、染色质组织和应激反应。HAPSTR1和HUWE1的缺失显著致敏，多色竞争生长实验证实了这一点，且HAPSTR1中单氨基酸缺失（ΔA96）即可导致功能丧失。

**2. HAPSTR1 recruits HUWE1 to the chromatin to regulate chromatin proteostasis**
AlphaFold3预测HAPSTR1残基23-134与HUWE1残基3014-3049形成紧凑的螺旋界面。A96缺失破坏该结合，质谱分析确认GFP-HAPSTR1的互作蛋白包括HUWE1、USP7和BAG6，而ΔA96突变体丧失与HUWE1的结合。染色质分级分离表明，HAPSTR1缺失导致HUWE1在染色质上的结合减少，同时积累了有丝分裂调控因子和泛素化组分。在TAK-243处理下，热休克蛋白HSPB1和HSPA1B在染色质上累积，HSF1磷酸化增加。RNA-seq显示细胞周期相关基因上调，提示细胞试图补偿染色质蛋白质稳态失衡。

**3. HAPSTR1 dynamics throughout the cell cycle**
活细胞成像显示，GFP-HAPSTR1在G2和M期高表达，有丝分裂后迅速下降。TAK-243或HUWE1 siRNA处理可阻止其在G1期的降解，MG132处理则使蛋白稳定并增强其多聚泛素化。同步化实验证实，内源HAPSTR1在M期达到峰值，随后经HUWE1依赖的UPS在G1期降解，形成负反馈调控回路。

**4. Rewired ubiquitinome reveals early activation of the CDK6 pathway upon HAPSTR1 loss**
UbiSite技术鉴定出HAPSTR1缺失细胞中1801个蛋白的7942个差异泛素化位点，其中CDK6的泛素化增加了3.5倍。CDK6蛋白丰度升高，Rb磷酸化增强，下游CCNE和E2F1的转录提前激活。CDC6的泛素化及蛋白水平也升高，而CDK4和CCND无显著变化，表明HAPSTR1对CDK6通路具有特异性调控作用。

**5. Loss of HAPSTR1 accelerates S phase entry and disrupts cell cycle integrity**
EdU标记与流式细胞术显示，HAPSTR1敲除细胞在TAK-243处理后出现早S期积累和复制缺陷。DNA纤维实验观察到复制叉速度降低，但起始点发放增加。TAK-243处理可恢复复制叉速度，但细胞中γH2AX焦点显著增多，表明DNA损伤累积。此外，HAPSTR1缺失导致有丝分裂进程延长，p27^Kip1蛋白水平上升而p21^Cip1下降，提示G1-S检查点受到干扰。

**讨论与结论**
讨论部分强调，HAPSTR1通过与HUWE1互作调控染色质蛋白质稳态，其自身在G2/M期积累、G1期被HUWE1降解，这种时序控制可能确保了有丝分裂前染色质相关蛋白的有效清除。HAPSTR1缺失后，细胞通过上调CDK6和CDC6试图维持增殖和复制起始，但在UPS抑制下，这种缓冲能力丧失，导致复制应激、早熟S期进入和基因组不稳定。研究还指出CDK6与CDK4的非冗余功能，并讨论了与AML筛选中差异的细胞类型特异性。

结论可翻译为：总之，本研究表明，HAPSTR1通过将HUWE1招募至染色质，维持染色质蛋白质稳态和细胞周期进程的保真性；HAPSTR1缺失与泛素信号阻断协同导致复制缺陷和细胞周期崩溃，从而凸显了蛋白质稳态失衡作为癌症细胞脆弱性的潜在治疗价值。