《Veterinary Sciences》：Construction and Immunogenicity Evaluation of a Ferritin-Based Nanoparticle Vaccine Displaying the PDCoV Spike Receptor-Binding Domain
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猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus, PDCoV）对全球养猪业构成重大威胁，凸显了开发有效疫苗的迫切性。本研究构建了一种自组装铁蛋白（ferritin）纳米颗粒疫苗，该疫苗展示PDCoV刺突蛋白受体结合域（receptor-bind
猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus, PDCoV）对全球养猪业构成重大威胁，凸显了开发有效疫苗的迫切性。本研究构建了一种自组装铁蛋白（ferritin）纳米颗粒疫苗，该疫苗展示PDCoV刺突蛋白受体结合域（receptor-binding domain, RBD），命名为PDCoV-S-RBD-FR，并对其免疫原性与安全性进行了评价。透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）显示，重组PDCoV-S-RBD-FR蛋白形成了平均直径为25.55 ± 4.39 nm的球形纳米颗粒。在小鼠中，PDCoV-S-RBD-FR免疫可诱导抗原特异性IgG应答，加强免疫后滴度达到1:40,960。免疫后观察到血清IFN-γ和IL-4水平显著升高。值得注意的是，病毒中和试验表明，该疫苗诱导了功能性中和抗体（滴度1:128），能够在体外有效阻断PDCoV诱导的细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）。对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的组织病理学检查显示，与PBS对照组相比，免疫小鼠未见显著病变，表明其在小鼠中具有良好的耐受性。综上，这些研究结果表明，基于铁蛋白的PDCoV-S-RBD纳米颗粒疫苗可诱导抗原特异性IgG应答，伴随血清细胞因子水平升高，并在体外具有功能性中和活性，且主要器官未见可检测的组织病理学改变，支持其作为抗PDCoV疫苗候选的进一步评价。
研究背景与问题
猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus, PDCoV）是一种高度传染性的肠道冠状病毒，属于δ冠状病毒属，于2012年在中国香港首次被发现，此后在全球多个养猪地区持续传播。该病毒可感染各年龄段猪只，其中哺乳仔猪和断奶仔猪的临床症状最为严重。PDCoV感染主要靶向肠道上皮细胞，导致绒毛萎缩和营养吸收障碍，临床表现为急性水样腹泻、呕吐、脱水和体重下降，幼龄动物死亡率可达30%–40%。PDCoV还具有广泛的宿主范围，实验条件下可感染犊牛、鸡和小鼠，且2021年有病例报告在海地三名儿童血清中检测到PDCoV特异性IgG抗体，提示其具有跨物种传播和人畜共患的潜在风险。长期以来，尚无商业化PDCoV疫苗可用；尽管2024年中国批准了一种基于CHN-HN-2014株的单价灭活疫苗作为新兽药，但灭活疫苗主要诱导系统性体液免疫，黏膜保护作用有限。因此，开发新一代疫苗平台仍是迫切需求。
研究内容与结论
针对上述问题，研究人员设计了一种基于铁蛋白（ferritin）纳米颗粒平台展示PDCoV刺突蛋白受体结合域（S-RBD）的疫苗候选，命名为PDCoV-S-RBD-FR。铁蛋白是一种天然存在的铁储存蛋白，由24个亚基自组装形成具有432对称性的空心纳米笼，具有高热稳定性和化学稳定性，适合作为外源抗原的多价展示支架。该研究将PDCoV S-RBD序列通过柔性连接肽融合至铁蛋白N末端，在哺乳动物表达系统中生产重组融合蛋白，并系统评价了其表达、自组装特性、免疫原性及安全性。结果表明，PDCoV-S-RBD-FR在小鼠中诱导了强烈的抗原特异性IgG应答，加强免疫后滴度达到1:40,960；同时显著提升了血清IFN-γ和IL-4水平；病毒中和试验证实其诱导的功能性中和抗体滴度达1:128，可在体外有效阻断PDCoV诱导的细胞病变效应。组织病理学检查显示主要器官无明显病变，体重监测无显著差异，提示疫苗在小鼠中具有良好的耐受性。该研究为PDCoV疫苗开发提供了一种新颖的抗原展示策略，拓展了铁蛋白纳米颗粒平台在兽医疫苗学中的应用。
主要技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：基于pCAGGS载体的真核表达质粒构建与验证；慢病毒三质粒包装系统生产重组慢病毒并转导ExpiCHO悬浮细胞实现规模化蛋白表达；Ni-NTA亲和层析纯化结合尿素梯度透析复性获得目标蛋白；透射电子显微镜（TEM）结合负染色技术表征纳米颗粒自组装形态与粒径分布；小鼠免疫模型采用腹腔注射、MF59佐剂乳化，共免疫三次；间接免疫荧光试验（IFA）检测抗原特异性IgG抗体；ELISA检测血清IFN-γ和IL-4细胞因子水平；病毒中和试验（VNT）评价功能性中和抗体；苏木精-伊红（H&E）染色进行主要器官组织病理学评价。实验动物为6周龄雌性ICR小鼠，购自江苏协通医药生物工程有限公司。
研究结果
重组质粒的构建与表达验证：通过双酶切和测序验证了pCAGGS-PDCoV-S-RBD-FR及铁蛋白对照质粒pCAGGS-FR的正确构建。转染HEK293T细胞后，SDS-PAGE和Western blot检测到约70 kDa和40 kDa的特异性条带（预测分子量分别为52.5 kDa和约34.4 kDa），确认融合蛋白在哺乳动物细胞中高效表达。
重组慢病毒的制备与滴度测定：成功构建慢病毒穿梭质粒pLVX-PDCoV-S-RBD-FR和pLVX-FR，经三质粒共转染包装重组慢病毒，荧光显微镜确认高效转染，病毒滴度分别达到8.6×107 TU/mL和2.95×107 TU/mL。
ExpiCHO细胞中的表达与纯化：重组慢病毒以MOI=20转导ExpiCHO悬浮细胞，48小时后观察到强烈绿色荧光，确认高效转导。目标蛋白主要在细胞沉淀组分中表达。经Ni-NTA亲和层析纯化和尿素梯度复性后，SDS-PAGE和Western blot验证了蛋白的纯度与抗原特异性。BCA法测定PDCoV-S-RBD-FR和FR的最终浓度分别为1 mg/mL和0.5 mg/mL。
纳米颗粒自组装表征：TEM负染色显示PDCoV-S-RBD-FR形成平均直径为25.55 ± 4.39 nm（CV=17%）的球形纳米颗粒，FR形成平均直径为16.01 ± 1.78 nm（CV=11%）的颗粒，两者粒径分布差异显著，表明两种重组蛋白均成功自组装为纳米颗粒结构。
抗原特异性IgG抗体应答：IFA检测显示，初次免疫后第14天即可在PDCoV-S-RBD-FR组和FR组检测到抗原特异性IgG抗体，而PBS对照组全程无特异性应答。加强免疫后，PDCoV-S-RBD-FR组IgG滴度显著升高并达到1:40,960，且该应答针对S-RBD抗原成分。FR支架本身也具有免疫原性，可诱导针对FR抗原的IgG应答。
血清IFN-γ和IL-4细胞因子应答：ELISA检测显示，除第0天外，PDCoV-S-RBD-FR组在各时间点的IFN-γ和IL-4浓度均显著高于PBS对照组。第42天时IFN-γ/IL-4比值大于1，但该比值仅作描述性报告。
中和抗体应答：病毒中和试验表明，PBS对照组血清处理的细胞出现严重细胞病变效应，而PDCoV-S-RBD-FR组血清处理的细胞保持正常形态，中和抗体滴度达到1:128，证实疫苗诱导了功能性中和抗体，可在体外阻断PDCoV感染。
主要器官组织病理学评价：H&E染色显示，PDCoV-S-RBD-FR组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏与PBS对照组相比均无显著病理改变。42天观察期内三组小鼠体重无显著差异，提示疫苗未引起系统性毒性或生长抑制。
讨论与结论
讨论部分指出，铁蛋白纳米颗粒的多价抗原展示可模拟病毒表位的空间排布，促进B细胞受体交联和生发中心反应，从而增强免疫应答。研究中观察到结合抗体滴度（1:40,960）与中和抗体滴度（1:128）之间存在约300倍的差距，这一现象在RBD展示型纳米颗粒疫苗中较为典型，结合抗体包含大量靶向免疫显性但非保护性表位的非中和克隆。与已有报道中采用细菌表达RBD二聚体并通过SpyTag/SpyCatcher系统偶联铁蛋白的PDCoV疫苗相比，本研究采用基因融合策略并在哺乳动物表达系统中生产，保留了天然翻译后修饰并省去了化学偶联步骤。研究也承认多项局限性，包括未设置可溶性S-RBD对照组、未进行病毒攻毒实验、小鼠模型与自然宿主猪存在差异、免疫剂量未按摩尔数归一化、中和抗体仅在终末时间点对部分小鼠测定、未评价抗原特异性T细胞应答、蛋白复性回收率未量化等。结论部分总结，该研究成功构建并表达了自组装铁蛋白纳米颗粒疫苗PDCoV-S-RBD-FR，该疫苗在小鼠中诱导了抗原特异性IgG应答、显著升高的IFN-γ和IL-4水平以及功能性中和抗体，且未观察到主要器官的组织病理学改变或不良效应，为PDCoV疫苗开发提供了新颖的抗原展示策略，未来需在自然宿主猪中开展病毒攻毒实验以进一步验证保护效力。
