发酵温度与孵育时间对牛乳基dadih理化、微生物、功能及质构相关特性的影响

《International Journal of Food Properties》：Effects of fermentation temperature and time on the physicochemical, microbiological, functional, and texture-related properties of cow milk-based dadih

　　

Dadih是一种印度尼西亚传统发酵乳制品，通过竹筒中的自发发酵生产。本研究评估了发酵温度和孵育时间对牛乳基dadih的理化、微生物、组成、DPPH自由基清除（DPPH radical-scavenging）响应、血清分离（serum separation）及质构相关特性的影响。采用4×4因子设计，组合四种温度（24、30、37、42°C）和四种孵育时间（18、24、30、36 h），每个处理使用三个独立发酵的竹筒。温度、孵育时间及其交互作用显著影响所有重复响应变量。在各处理中，pH范围为4.77至6.60，滴定酸度为0.417%至1.252%乳酸（lactic acid），LAB计数（LAB counts）为6.01至8.36 log₁₀ CFU/g，酵母-霉菌计数（yeast–mould counts）为6.68至7.23 log₁₀ CFU/g，水分为55.37%至81.17%，蛋白质为2.81%至13.45%，DPPH自由基清除响应（DPPH radical-scavenging response）为72.17%至86.53%，残余离心诱导血清分离（residual centrifugation-induced serum separation）为0.07%至39.25%。主成分分析（principal component analysis，PCA）显示，前两个成分解释了79.1%的总方差，主要根据pH、水分、酸度、LAB计数和湿基固形物（wet-basis solids）分离各处理。质构数据为描述性结果，因为每个处理仅测量一次，而氨基酸和总DNA分类学谱为探索性结果，仅限T1I1处理。总体而言，发酵温度和孵育时间显著改变了牛乳基dadih的特性，尽管该研究未确立最佳处理条件、微生物安全性、感官可接受性或工业适宜性。

**研究背景与目的**

传统发酵乳制品是微生物代谢、酸化及乳基质重塑同时发生的动态系统。印度尼西亚传统乳制品dadih通常在竹筒（Bambusa blumeana）中通过自发发酵生产，传统上多与水牛乳相关；以牛乳为替代基质，可探究竹筒相关自发发酵对受控温度与孵育时间条件的响应。发酵过程中有机酸积累降低pH，使酪蛋白胶束失稳，促进酸诱导凝乳基质的形成。发酵温度和孵育时间是影响微生物生长、产酸和发酵乳物理性质的主要工艺因素，但温度与孵育时间对竹筒中自发发酵牛乳基dadih的联合效应——尤其是对酸化、微生物种群、组成、离心诱导血清分离、DPPH自由基清除响应及质构相关性质的影响——仍缺乏充分表征。已有研究多集中于传统水牛乳dadih，或使用特定dadih源起始培养物考察温度效应，而对牛乳基dadih在竹筒中自发发酵的温度×时间交互作用研究不足。为此，研究人员采用4×4因子设计，假设发酵温度和孵育时间相互作用，引发酸化和微生物生长的协调变化，并伴随水分、湿基组成、离心诱导血清分离及DPPH自由基清除响应的改变；质构压缩行为作为补充结构响应进行描述性评价，氨基酸组成和总DNA宏基因组分类谱则在选定T1I1样品中进行探索性分析。该研究旨在确定处理相关的分析变化及其相互关系，而非确立感官可接受性、微生物安全性、商业就绪性或最佳工业发酵条件。

**主要结论与意义**

研究表明，发酵温度、孵育时间及其交互作用显著影响牛乳基dadih的理化、微生物、组成、离心诱导血清分离及DPPH自由基清除响应。较长孵育时间尤其37–42°C通常伴随较低pH和水分、较高滴定酸度和LAB计数，但该模式并非在所有处理中统一。多变量分析显示从高pH/高水分到高酸度/LAB计数/高湿基固形物的梯度变化，这些关系为共变而非因果关系。研究未确立最佳处理条件，且高酵母-霉菌计数以及缺乏病原体检测、霉菌毒素分析、感官评价和货架期评估，阻碍了关于产品安全性、接受度或工业适用性的结论。该研究为后续系统优化牛乳基dadih发酵工艺提供了多维度分析框架和基础数据集。

**关键技术方法**

样本包括印度尼西亚东爪哇谏义里县Semen区的新鲜牛乳，以及Pare区约2–3年生Bambusa blumeana竹筒（内径6–8 cm，未洗涤、未灭菌以保留本土微生物）。牛乳经85°C加热30分钟标准化后，采用4×4因子完全随机设计，设四种温度（24、30、37、42°C）和四种孵育时间（18、24、30、36 h），每处理三个独立竹筒作为生物学重复。主要方法包括pH电极法、NaOH滴定酸度、MRS/PDA倾注平板计数LAB与酵母-霉菌、烘箱干燥水分、滤袋溶剂提取粗脂肪、凯氏定氮粗蛋白、马弗炉灰化灰分、差值法碳水化合物、DPPH分光光度法、离心法血清分离、单压缩质构测试；统计采用双因素方差分析、Duncan多重比较、ART敏感性分析、PCA、层次聚类及Pearson相关。氨基酸和宏基因组测序（Oxford Nanopore PromethION，Kraken2/Bracken）仅针对T1I1样品。

**研究结果**

*酸化和微生物响应*

双因素方差分析表明，发酵温度、孵育时间及交互作用显著影响pH（4.77–6.60）、滴定酸度（0.417%–1.252%乳酸）、LAB计数（6.01–8.36 log₁₀ CFU/g）和酵母-霉菌计数（6.68–7.23 log₁₀ CFU/g）（p<.05）。18 h处理pH较高，反映早期发酵阶段；较长时间孵育尤其在37–42°C通常伴随较低pH和较高酸度及LAB计数，但模式因温度而异。酵母-霉菌计数在所有处理中持续高位，表明酸化未能消除真菌种群。

*水分分布和湿基组成*

温度、孵育时间及交互作用显著影响水分（55.37%–81.17%）、湿基组成和离心诱导血清分离（0.07%–39.25%）。较低水分处理通常显示较高蛋白质（2.81%–13.45%）、脂肪和灰分百分比。干基值显示水分影响表观湿基组成，但校正后处理间仍存在明显变异。低离心诱导血清分离值不一定表示更高保水性，因部分乳清可能在取样前已分离。

*DPPH和质构相关响应*

DPPH自由基清除响应范围为72.17%–86.53%，并非每个温度下均随孵育时间一致增加。最大压缩力为0.1138–3.7408 N，破裂力为0.0328–3.5787 N；37–42°C发酵24–36 h的一些处理出现较高力值，与酸诱导乳凝胶的物理行为变化一致。因每处理仅一次测量，质构结果属描述性，未进行推断统计。

*综合多变量模式*

PCA显示PC1解释58.3%，PC2解释20.8%，累计79.1%。PC1分离高pH/高水分处理与高酸度/LAB计数/湿基固形物处理；PC2主要与血清分离、酵母-霉菌计数和DPPH响应相关。LAB计数与DPPH响应间相关性弱且不显著（r=0.11）。层次聚类将16个处理按综合分析谱分组，与PCA结果一致。

*探索性氨基酸和宏基因组谱*

T1I1样品含18种氨基酸，L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-赖氨酸和L-异亮氨酸浓度最高，与牛乳蛋白氨基酸谱基本一致。宏基因组总DNA谱以Pseudomonadota、Gammaproteobacteria、Enterobacterales和Enterobacteriaceae为主，Lactobacillales占较小部分；这与MRS平板培养结果不一定冲突，因培养法与DNA直接检测原理不同。真核序列大部分分配给Bos taurus，符合牛乳基质来源。

**讨论与结论**

研究人员指出，湿基蛋白质百分比的较大变异无法仅用水分损失解释，因为未测量凝乳产量、乳清质量和组分回收；碳水化合物差值法不能视为直接测量的乳糖或可发酵碳水化合物；总DNA测序无法区分活菌与非活菌或残留细胞外DNA；高酵母-霉菌计数以及缺乏病原体检测、霉菌毒素分析、感官评价、货架期评估和更广泛安全性评价，妨碍了关于产品安全性、接受度、商业就绪性或工业标准化的任何结论。研究结论为：发酵温度、孵育时间及其交互作用显著影响牛乳基dadih的理化、微生物、组成、离心诱导血清分离和DPPH自由基清除响应；较长孵育时间尤其37–42°C通常伴随较低pH和水分、较高滴定酸度和LAB计数，但模式并非在所有处理中统一；多变量分析显示这些关系为共变而非因果。进一步优化需综合感官品质、微生物安全、货架稳定性、营养属性、凝乳-乳清质量平衡和目标质构的整合评价。