《IBRO Neuroscience Reports》：Identification of m5C-associated gene signatures in Alzheimer's disease and their relationship with immune infiltration
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背景： 阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种进行性神经退行性疾病，具有复杂的遗传、表观遗传和免疫组分。本研究考察了AD中m5C相关基因表达特征，并探讨了其生物学及免疫细胞关联。
方法： 采用两个GEO数据集（GSE132903和G
背景： 阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种进行性神经退行性疾病，具有复杂的遗传、表观遗传和免疫组分。本研究考察了AD中m5C相关基因表达特征，并探讨了其生物学及免疫细胞关联。
方法： 采用两个GEO数据集（GSE132903和GSE118553）进行发现阶段分析，以GSE33000和GSE122063作为外部表达评估数据集。研究人员进行了差异表达分析、GO/KEGG富集分析、基因集富集分析（GSEA）、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析、调控网络构建、CIBERSORTx免疫浸润分析和受试者工作特征（ROC）曲线分析。筛选出的候选基因进一步通过RT-qPCR在4月龄雄性5×FAD小鼠及年龄匹配的野生型（WT）对照（每组n=5）的皮层和海马中进行验证。
结果： 研究人员鉴定出5个m5C相关差异表达候选基因（ZBTB4、MBD4、ZBTB33、NEIL1和TDG）。ZBTB4在多个人类数据集中表现出可重复的表达差异，但其ROC曲线下面积（AUC）值（0.657、0.605和0.569）表明其单独判别性能有限。基因-免疫细胞相关性在统计学上显著但较弱。在5×FAD模型中，与WT对照相比，Zbtb4和Mbd4的mRNA水平在皮层和海马中均显著降低。
结论： 综合分析鉴定了AD中候选的甲基化/m5C相关表达变化，并为Zbtb4和Mbd4提供了体内转录水平的佐证。ROC和免疫浸润结果应视为探索性发现，不能确立临床诊断效用或因果免疫机制。
论文解读
一、研究背景与意义
阿尔茨海默病是影响全球老年人群的最主要神经退行性疾病，常导致痴呆。该病以神经元丢失、记忆损害和认知能力下降为主要表现，呈进行性、不可逆发展，目前尚无治愈手段。全球AD患者已超过5500万且持续增长，构成重大公共卫生挑战。1990年至2019年间，AD的发病率和患病率增加了147.95%，疾病负担在全球范围内持续上升。此外，AD患者对SARS-CoV-2感染更易感，且临床结局更差、死亡率更高。尽管基因检测和神经影像技术的进步为早期诊断带来了希望，但仍有近半数AD患者未被诊断。因此，深入理解AD的分子机制、发现新的生物标志物以实现及时检测至关重要。
AD的发病机制涉及遗传与表观遗传的交互作用。RNA修饰作为转录后调控的额外层面日益受到关注，其中5-甲基胞嘧啶（m5C）存在于多种RNA物种中，可影响RNA的稳定性、加工和翻译。已有研究将RNA修饰通路异常与神经退行性疾病和癌症联系起来。NSUN2作为特征明确的RNA m5C甲基转移酶，已被发现与tau相关神经退行性变有关，支持在AD中开展m5C相关分子变化的研究。同时，m5C相关调控也被认为与免疫和炎症过程有关，例如NSUN2介导的RNA甲基化可增加高同型半胱氨酸血症条件下白细胞介素-17A的表达，m5C模式的改变与免疫、细胞因子和干扰素相关通路相关联。然而，AD中m5C与免疫关系的证据仍然有限。本研究旨在通过公共脑转录组数据集，鉴定与文献来源的甲基化/m5C相关基因panel重叠的AD相关表达变化，并进一步探索功能富集、分子互作网络、免疫细胞去卷积及候选基因的判别性能，同时通过动物模型进行实验验证。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员从基因表达综合数据库（GEO）获取了4个AD相关数据集：GSE132903（93例对照、102例AD）、GSE118553（100例对照、166例AD）、GSE33000（157例对照、310例AD）和GSE122063（44例对照、56例AD）。主要技术方法包括：利用limma包在各数据集内分别进行差异表达分析；采用Venn分析获取两个发现数据集的共同差异表达基因（DEGs），并与文献来源的20基因甲基化/m5C相关panel取交集；使用clusterProfiler进行GO/KEGG富集分析；利用MSigDB基因集进行基因集富集分析（GSEA）；通过STRING数据库（中等置信度阈值>0.400）和Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络；利用ENCORI/starBase、miRDB、ChIPBase、hTFtarget和CTD数据库构建mRNA-miRNA、mRNA-TF和mRNA-化合物互作网络；使用CIBERSORTx结合LM22特征矩阵估计22种免疫细胞比例并计算Spearman相关性；绘制ROC曲线评估判别性能；最后在4月龄雄性5×FAD小鼠和年龄匹配的WT对照（每组n=5，来自首都医科大学）的皮层和海马中通过RT-qPCR进行实验验证，以Hprt1和Gapdh为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。
三、研究结果
3.1 研究设计概览与候选基因鉴定
研究人员分别对GSE132903和GSE118553进行数据内标准化处理。差异表达分析采用名义P<0.05且非零log2FC的探索性筛选标准。在GSE132903中，15388个基因达到阈值（8240个上调、7148个下调）；在GSE118553中，11005个基因达到阈值（5396个上调、5609个下调）。两个数据集的共同DEGs与20基因panel交集后鉴定出5个候选基因：ZBTB33、TDG、ZBTB4、NEIL1和MBD4。
3.2 GO和KEGG富集分析
对5个候选基因的GO和KEGG分析显示，富集条目包括嘧啶核苷酸分解代谢过程、嘧啶脱氧核苷酸代谢过程、碱基切除修复/AP位点形成以及DNA N-糖基化酶活性等，与panel中多个基因已知的DNA修复功能一致。
3.3 基因集富集分析（GSEA）
多重检验校正后，GSE132903中WP_METABOLIC_REPROGRAMMING_IN_COLON_CANCER通路仍显著（校正P=0.0286）；GSE118553中PID_BETA_CATENIN_NUC_PATHWAY和BIOCARTA_P38MAPK_PATHWAY仍显著（校正P=0.0386）。凋亡、脂肪酸代谢、昼夜节律、Hedgehog配体生物合成和自噬等基因集仅达到名义P<0.05，作为探索性模式呈现。
3.4 PPI网络与枢纽基因优先排序
利用STRING和Cytoscape构建5个候选基因的PPI网络，采用MCC、EPC、DMNC、BottleNeck和聚类系数五种算法进行网络排序，MBD4被优先列为连接度较高的候选基因之一。
3.5 mRNA-TF、mRNA-化合物和mRNA-miRNA互作网络构建
整合ChIPBase和hTFtarget数据库，保留153个TF-mRNA互作关系；从CTD数据库获得10个化合物关联；ENCORI和miRDB筛选后保留87个mRNA-miRNA配对，分别构建了相应的调控网络。
3.6 探索性免疫浸润分析（CIBERSORTx）
在GSE132903中，ZBTB33与单核细胞丰度正相关（r=0.300，P<0.001），ZBTB4与CD8+ T细胞丰度正相关（r=0.186，P=0.009），NEIL1与单核细胞丰度负相关（r=-0.207，P=0.004）。在GSE118553中观察到类似但较弱的关联。这些相关性幅度较小，被解释为弱关联而非功能关系。
3.7 外部表达评估与ROC分析
ZBTB4在GSE132903、GSE118553和GSE33000中均表现出一致的差异表达，在GSE122063中ZBTB4和MBD4也存在组间差异。ZBTB4的ROC分析AUC值分别为0.657、0.605和0.569，表明其单独判别能力有限，不支持作为临床诊断生物标志物。
3.8 5×FAD小鼠RT-qPCR实验验证
在4月龄雄性5×FAD小鼠皮层和海马中，Zbtb4表达显著降低（皮层P=0.033，海马P<0.001），Mbd4表达也显著降低（皮层P=0.024，海马P=0.0013），为转录组发现提供了跨物种、跨脑区的体内转录水平佐证。
四、讨论与结论
研究人员强调，5个候选基因中ZBTB4在多个数据集中表现出相对一致的表达差异，但AUC值显示其单独判别能力有限，应视为需进一步研究的候选表达标志物而非已证实的诊断生物标志物。GO/KEGG富集结果与TDG、MBD4和NEIL1的DNA修复功能一致。GSEA中显著的通路名称来源于癌症导向数据库，应理解为共享转录程序而非疾病特异性机制。免疫细胞相关性虽然显著但幅度很小，且CIBERSORTx质量指标无法在两个数据集中统一应用，应视为探索性关联。网络分析将MBD4置于较高中介位置，但仅提供候选调控关系。RT-qPCR结果提供了跨物种转录水平佐证，但不验证人类诊断性能，也不确立蛋白水平调控或因果功能。研究局限性包括：人类分析为回顾性研究且依赖异质性公共数据集；原始DEG筛选采用宽松的非零倍数变化标准；20基因panel混合了直接RNA-m5C相关生物学与DNA甲基化和碱基切除修复基因；CIBERSORTx相关性弱且探索性；RT-qPCR验证仅涉及小样本雄性5×FAD小鼠且仅检测mRNA。
研究结论： 综合转录组分析鉴定出5个甲基化/m5C相关候选基因（ZBTB33、TDG、ZBTB4、NEIL1和MBD4）在AD与对照脑样本间存在差异表达。ZBTB4表现出可重复的表达差异但ROC单独判别能力有限。5×FAD小鼠模型的RT-qPCR验证了皮层和海马中Zbtb4和Mbd4 mRNA表达的降低。与推断的单核细胞和CD8+ T细胞丰度的关联较弱，应视为探索性发现。这些结果为后续机制和临床验证提供了候选分子信号和假说，而非确立诊断生物标志物或因果免疫通路。
