毕赤酵母中重组蔗糖异构酶用于生产作为替代甜味剂的异麦芽酮糖

《Food and Bioproducts Processing》：Recombinant Sucrose Isomerases in Pichia pastoris for the Production of Isomaltulose as an Alternative Sweetener

　　

摘要

蔗糖作为一种甜味剂被广泛消费；然而，过量摄入与不良健康结果相关。本研究利用重组蔗糖异构酶（SIases）探讨了将蔗糖酶促异构化为异麦芽酮糖（一种功能性异构体）的过程。通过生物信息学筛选，选择了来自Burkholderia ubonensis和最新鉴定的Lonsdalea britannica的SIases，并将其编码序列优化用于在Pichia pastoris中进行异源表达。以蔗糖为底物、培养上清液为生物催化剂，通过催化活性测定确认了功能性表达和分泌。确定了最佳pH和温度条件以及金属离子对酶活性的影响。随后评估了重组酶提取物对甘蔗糖蜜（一种丰富的农业工业副产品）中存在的蔗糖的直接异构化能力。值得注意的是，B. ubonensis SIase利用粗制培养上清液催化蔗糖转化，消除了对该生物催化剂进行下游纯化的需求。P. pastoris被证明是产生和分泌活性SIases的有效宿主，所得结果为简化蔗糖增值生物催化平台的可行性提供了初步证据。该策略为异麦芽酮糖的可持续生产提供了基础，同时促进了甘蔗糖蜜的增值利用。

推文摘要

在Pichia pastoris中生产的重组蔗糖异构酶实现了甘蔗糖蜜向替代甜味剂的生物转化，无需纯化酶，支持了可持续生物工艺。

引言

蔗糖是自然界中含量最丰富的二糖，主要来自甘蔗和甜菜，在食品和糕点工业中是一种普遍使用的甜味剂（Tian等，2019）。蔗糖由一个葡萄糖分子和一个果糖分子通过1-2键连接而成，其在消化道中的快速水解导致血糖水平升高，加剧了健康隐患（Han等，2021）。此外，口腔微生物群发酵蔗糖，产生多聚糖，促进牙菌斑形成和牙釉质脱矿，从而导致龋齿（Anderson等，2018, Cai等，2021）。蔗糖消费相关的不良健康影响，包括肥胖以及II型糖尿病和心血管疾病等慢性病，突显了寻找更健康替代甜味剂的紧迫性（Novik等，2023）。

糖消费的普及，主要由含糖饮料和烘焙食品推动，促使开发新策略在保留食品口感和甜味的同时降低糖含量（Novik等，2023）。各种天然和人工蔗糖替代品已被探索以应对这一挑战（Liauchonak等，2019）。虽然阿斯巴甜和糖精等人工甜味剂提供甜味但无热量，但对其安全性和代谢效应的担忧促使人们对天然替代品产生兴趣（Warner，2024）。

在天然替代品中，蔗糖异构体如异麦芽酮糖和海藻酮糖因其比蔗糖更慢的消化和更低的血糖反应而脱颖而出（Weysser Felipe Candido de Souza等，2022）。这些异构体天然存在于蜂蜜、花粉和甘蔗中，提供约为蔗糖一半的甜味，且无其他天然替代品所伴随的持续余味（Fletcher等，2020, Tian等，2019）。

先前的研究报告指出，异麦芽酮糖和海藻酮糖在人体胃肠道中的消化速度较慢，且血糖反应低于常规蔗糖（Fletcher等，2020, Tian等，2019; Weysser Felipe Candido de Souza等，2022）。这种较慢的消化有助于减少餐后血糖峰值，有利于代谢健康，特别是在预防心血管疾病和改善胰岛素敏感性方面。这些先前报道的特性支持了人们对酶法生产这些蔗糖异构体作为替代甜味剂的兴趣。负责这一转化的酶——蔗糖异构酶——已在各种微生物菌株中被鉴定和表征，为工业化生产提供了见解（Nam等，2014; F. Zhang等，2021）。

此外，甘蔗糖蜜的利用——一种含糖量高的粘性糖厂副产品——代表了一个可持续生物生产的机会（Wang等，2021）。甘蔗糖蜜传统上被丢弃或用于低价值应用，但它含有大量适合生物转化为增值生物产品的糖类（S. Zhang等，2021）。通过酶法或微生物转化过程，甘蔗糖蜜可被转化为具有多种用途的化合物，从甜味剂和生物燃料到特种化学品，从而减轻其处置所带来的环境污染和资源浪费（Bumroongsri，2024）。

Pichia pastoris作为一种非致病性酵母，由于其安全特性和在工业生物技术中的成熟应用，成为生产蔗糖异构酶的有前景的宿主。其使用使得生产无内毒素的酶，从而促进下游加工、产品回收和纯化。此外，P. pastoris的基因改造为提高酶产量和活性提供了机会，进一步优化了生物生产过程（Barone等，2023, Zhang等，2019）。

除了其GRAS（一般公认安全）状态和高效的分泌能力外，P. pastoris已成为领先的真核平台之一，用于重组蛋白生产，因为它能够达到高细胞密度并支持适合工业酶制造的可扩展生物过程（Duman-?zdamar和Binay，2021, Ergün等，2021）。近期在菌株工程、启动子设计和生物工艺优化方面的进展进一步扩展了其潜力，通过提高重组蛋白生产力和实现使用替代性低成本碳源以实现更可持续的生产过程（Ergün等，2022, Ergün等，2021）。这些发展使P. pastoris成为循环生物经济框架下，用于生产旨在增值可再生原料和农业工业副产品酶的微生物细胞工厂的有吸引力的选择（?alo?lu和Binay，2023, Ergün等，2022）。在此背景下，在P. pastoris中胞外生产SIases代表了一种潜在合适的策略，将重组酶生产与甘蔗糖蜜（一种丰富的农业工业副产品）的直接转化为增值功能性甜味剂相结合。

通过整合生物技术策略的多学科方法，我们提出了一种替代方案，可通过酶促异构化利用甘蔗糖蜜中丰富的蔗糖含量。在此背景下，两种来自Burkholderia ubonensis（BU）和Lonsdalea Britannica（LB）的SIase酶在P. pastoris异源表达系统中进行了胞外生产，并评估了其催化蔗糖异构化的能力。

章节摘要

生物信息学分析

使用BlastP程序，以Burkholderia ubonensis（GenBank: ABC33903.1）和Pectobacterium carotovorum（GenBank: AGT14432.1）的SIases为查询序列，在GenBank数据库中对新SIase肽序列进行了生物信息学探索。在此搜索后，使用InterProScan工具和NetNGlyc 1.0对所得序列的信号肽、N-糖基化位点、基序和结构域进行了预测分析（Blum等，2025, Gupta和Brunak，2002）。

肽序列的搜索与分析

旨在鉴定用于生产替代甜味剂的新型推定SIases，使用Pectobacterium carotovorum SIase（GenBank: AGT14432.1）作为查询，在NCBI数据库中进行了生物信息学搜索，检索到多个先前报道的序列。其中，选择了两个候选者在GRAS酵母Pichia pastoris中进行异源表达：来自Burkholderia ubonensis（BU）——原Pseudomonas mesacidophila（Watzlawick和Mattes，2009）——的SIase——以及

结论

本研究描述了两种来自Burkholderia ubonensis和Lonsdalea britannica的蔗糖异构酶（SIases）在Pichia pastoris中的异源表达和表征。据我们所知，这是首次报道来自L. britannica的SIase的鉴定和生化表征，扩展了该酶家族已知酶的多样性。

两种重组酶均成功分泌到胞外培养基中，并在较宽的范围内表现出活性

手稿撰写过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在本工作准备过程中，作者使用了ChatGPT来改善手稿的语言和可读性。使用此工具后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对已发表文章的内容承担全部责任。

未引用参考文献

（B?rnke等，2001, Hellmers等，2015, Lee等，2008, Véronèse和Perlot，1999, Zhang等，2002, Zhang等，2021）

CRediT作者贡献声明

Julieta Magalí Frescura: 撰写–审阅与编辑、撰写–初稿、可视化、验证、方法论、调查研究、形式分析。Arley David Zapata-Zapata: 撰写–审阅与编辑、获取资金、概念化。Sebastián Fernando Cavalitto: 撰写–审阅与编辑。Natalia Lorena Rojas: 撰写–审阅与编辑、撰写–初稿、可视化、验证、监督、项目管理、获取资金、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些关系可能影响本论文中报告的工作。

致谢

本工作得到了哥伦比亚国立大学研究副校长办公室（49980）、国家科学技术研究委员会（CONICET）以及基尔梅斯国立大学（PUNQ项目）的支持。

Julieta Magalí Frescura|Arley David Zapata-Zapata|Sebastián Fernando Cavalitto|Natalia Lorena Rojas

酶生物过程实验室，基础与应用微生物学研究所，科学技术系，基尔梅斯国立大学，国家科学技术研究委员会（CONICET），Roque Sáenz Pe?a 352号，贝尔纳尔（1876），阿根廷