食物来源多环芳烃破坏小鼠、猪和人肠上皮细胞的肠道屏障与外源物代谢

《Food and Chemical Toxicology》：Food-Relevant Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Disrupt Intestinal Barrier and Xenobiotic Metabolism in Mouse, Pig, and Human Epithelial Cells

　　

尽管多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的致癌性已被充分证实，但其经膳食摄入后对肠道细胞的影响仍知之甚少。此外，毒理学研究常基于动物模型，而外源物代谢的种间差异可能限制向人体的外推。本研究调查了七种食物来源的多环芳烃——苯并[a]蒽（benz[a]anthracene，BAA）、苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）、苯并[b]荧蒽（benzo[b]fluoranthene，BBF）、苯并[k]荧蒽（benzo[k]fluoranthene，BKF）、?（chrysene，CHRY）、茚并[1,2,3-cd]芘（indeno[1,2,3-cd]pyrene，INDE）和二苯并[a,h]蒽（dibenz[a,h]anthracene，DBAHA）——在小鼠（C57BL/6）、猪（IPEC-J2）和人（HIEC-6）肠上皮细胞中的细胞毒性和毒理基因组学效应。活力测定显示，这些多环芳烃在小鼠和猪模型中的半数致死浓度（LC50）分别为5–7 μg/mL和6–9 μg/mL，而在人细胞中则为12–17 μg/mL。在所有细胞系中均观察到对多环芳烃暴露保守的转录响应，包括外源物代谢基因（ahr、cyp1a1、cyp1b1、gst）和增殖标志基因（ki67）的上调，以及屏障与连接基因（muc2、cdh1）的下调。经多环芳烃处理的HIEC-6细胞表现出代谢激活，其中cyp1a1和cyp1b1上调超过32倍。免疫荧光显微镜实验支持了研究人员关于多环芳烃处理后MUC2蛋白减少的发现。由于BaP可能无法完全代表所有多环芳烃的毒性，本研究提供了肠道毒性的相关定量基准，推进了对当前多环芳烃暴露风险评估的认识。

研究背景与科学问题

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）作为烧烤食品中的污染物，其全球关注度日益增加。美国环境保护署已将16种PAHs列为优先监测对象，其中苯并[a]蒽（BAA）、苯并[a]芘（BaP）、苯并[b]荧蒽（BBF）、苯并[k]荧蒽（BKF）、?（CHRY）、二苯并[a,h]蒽（DBAHA）和茚并[1,2,3-cd]芘（INDE）在食品中含量较高。尽管BaP的遗传毒性和致癌机制已被广泛研究，但其毒性特征并不能完全代表其他结构不同的PAHs。不同PAHs因分子构型（如湾区或峡湾区结构）差异，可产生独特的二醇环氧化物代谢产物，进而影响其与芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）的结合、代谢活化及致癌潜力。然而，这七种食物来源PAHs对肠道上皮细胞增殖、黏蛋白分泌、外源物代谢通路及致癌性的基因水平效应尚不明确。同时，小鼠和猪等动物模型虽常用于PAH毒理学研究，但由于基因调控和代谢方面的种间差异，其结果向人体外推存在局限性。因此，有必要在多种哺乳动物肠上皮细胞模型中系统评估这些PAHs的生物学效应。

研究方法概述

研究人员选用三种原代非癌性肠上皮细胞系：C57BL/6小鼠小肠上皮细胞、IPEC-J2猪小肠上皮细胞和HIEC-6人肠上皮细胞。首先通过MTS法优化溶剂（二甲基亚砜，DMSO）浓度以排除溶剂毒性干扰，随后利用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）验证PAHs储备液浓度。采用MTS法测定各PAHs在不同细胞系中的半数致死浓度（LC₅₀）。通过逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测与细胞增殖（ki67）、肠道屏障（muc2、cdh1）和外源物代谢（ahr、gst、cyp1a1、cyp1b1）相关基因的表达变化。此外，利用免疫荧光染色评估MUC2蛋白表达水平。

研究结果

3.1 溶剂优化实验表明0.025%（v/v）DMSO是与哺乳动物细胞系兼容的最佳溶剂浓度：通过比较DMSO、乙腈和丙酮对三种细胞活力的影响，发现0.025%（v/v）DMSO可维持大于91%的细胞活力，且与阴性对照无显著差异，因此被确定为后续实验的最适溶剂浓度。

3.2 GC-MS分析实现了PAHs浓度的精确制备与分析验证：研究人员开发了一套结合超声溶解、过滤去除未溶固体和GC-MS定量验证的方案，确保PAHs储备液浓度的准确性。标准曲线线性良好（r²=0.9928–0.9985），实测浓度接近目标范围。

3.3 MTS法揭示PAHs诱导的细胞毒性在原代哺乳动物肠上皮细胞中存在显著的细胞类型依赖性差异：在IPEC-J2细胞中，LC₅₀值范围为6.69±0.33 μg/mL（BKF）至9.06±0.38 μg/mL（BaP）；在C57BL/6细胞中，LC₅₀值为5.56±0.26 μg/mL（BKF）至7.84±0.32 μg/mL（CHRY）；在HIEC-6细胞中，LC₅₀值为12.45±0.86 μg/mL（CHRY）至17.87±0.61 μg/mL（BBF）。总体而言，小鼠和猪细胞对PAHs更为敏感，而人细胞耐受性更强。BKF和BAA在所有细胞系中均表现出较高的细胞毒性，而BBF和BaP相对较低。这种差异部分可由湾区二醇环氧化物假说解释，即含有明显湾区或峡湾区的PAHs（如INDE、BAA、DBAHA）更易形成高反应性中间体，从而降低LC₅₀值。

3.4 单个PAHs差异调控参与细胞增殖、屏障保护、外源物代谢和致癌作用的基因标志物：免疫荧光实验显示，PAHs处理导致三种细胞中MUC2蛋白表达显著下降，其中IPEC-J2细胞降幅最大（约63%），C57BL/6和HIEC-6细胞分别降低约42%和40%。RT-qPCR结果显示，在各PAHs的LC₅₀浓度下，所有细胞系均呈现一致的转录谱：增殖标志基因ki67上调，屏障功能基因muc2和肿瘤抑制标志基因cdh1下调，外源物代谢通路基因（ahr、gst、cyp1a1、cyp1b1）上调。然而，各基因响应的幅度和具体化合物效应因细胞系而异。值得注意的是，在HIEC-6细胞中，cyp1a1表达上调近64倍，cyp1b1上调超过45倍，表明人肠上皮细胞具有更强的代谢激活能力。cdh1的下调在C57BL/6细胞中最为显著（约4倍），而在HIEC-6细胞中较为温和（2–4倍）。

讨论与结论

本研究表明，七种食物来源PAHs在三种哺乳动物肠上皮细胞中诱导了保守的转录响应，包括外源物代谢基因上调和屏障基因下调，但细胞毒性存在显著的种间和化合物特异性差异。人HIEC-6细胞较小鼠和猪细胞对PAHs具有更高的耐受性，这可能与其独特的代谢谱和内在生化防御机制有关。PAHs诱导的ki67上调与muc2、cdh1下调共同构成了一种病理应激相关的分子特征，而非适应性生存机制。AhR-CYP1通路的过度激活可能从保护性机制转变为损伤性过载，加速细胞损伤。此外，cyp1a1相对于cyp1b1更高的诱导倍数，体现了CYP1家族内部的功能冗余与差异化调控。这些发现填补了除BaP外其他六种PAHs在肠上皮细胞中LC₅₀数据的空白，强调了BaP不能完全代表所有PAHs的肠道毒性。研究结果为PAHs暴露风险评估提供了关键的定量基准，并揭示了在毒理学外推中考虑种间差异的重要性。