引言
在可持续和健康饮食理念的驱动下，植物蛋白正日益替代动物蛋白，成为食品体系中重要的结构性和功能性组分（Yanni, Iakovidi, Vasilikopoulou, & Karathanos, 2023）。与动物蛋白相比，植物蛋白在生产过程中环境负担更小，来源更加可持续，且不受文化和宗教限制，因此在肉制品替代品和功能食品领域具有明显优势（Jafari, Doost, Nasrabadi, Boostani, & Van der Meeren, 2020; Nasrabadi, Goli, Doost, Dewettinck, & Van der Meeren, 2019; Poore & Nemecek, 2018）。其中，植物蛋白水凝胶凭借高含水量、可调三维网络结构以及良好的加工适应性，被视为构建新型食品结构和实现营养递送的理想材料。然而，传统大豆蛋白水凝胶通常存在凝胶化过程复杂、机械强度不足和结构稳定性有限等问题，限制了其在实际应用中实现理想质构以及作为功能性营养成分递送载体的能力（Liu et al., 2018; Lv et al., 2025）。因此，开发具有优异机械性能和食品体系适用性的高性能大豆蛋白水凝胶仍是一项关键的科学与工程挑战。
水凝胶是吸水膨胀的交联聚合物网络，其机械性能（包括强度和韧性）从根本上取决于三维网络的拓扑结构和连通性，而非简单的颗粒聚集（X. Li & Gong, 2024）。然而，在热诱导或物理诱导的凝胶化过程中，天然大豆蛋白通常经历快速分子聚集，形成颗粒型凝胶，其中松散连接的聚集体作为基本结构单元（Renkema, 2004; Verheul, Roefs, Mellema, & de Kruif, 1998）。这种以聚集为主导的网络高度不均匀，聚集体间的连接位点有限且脆弱，无法在大变形条件下有效地传递和耗散外部应力。从结构设计角度来看，提升蛋白水凝胶的机械性能需要突破聚集主导的颗粒网络模式，通过精确调控分子构象和聚集行为，构建更加连续、均匀且高度互联的凝胶基质。先前的研究表明，pH调节、离子强度调制和热处理等策略可以部分破坏天然大豆蛋白聚集体，增强分子间相互作用，从而改善凝胶的整体内聚性和稳定性（N. Chen, Zhao, Chassenieux, & Nicolai, 2016; Renkema, Gruppen, & Van Vliet, 2002）。此外，蛋白质纤维化也被提出作为一种替代性的结构调控策略，即将球形蛋白转化为纤维状组装体，形成具有增强强度和韧性的各向异性网络（Khalesi, Sun, He, Lu, & Fang, 2021; Ye et al., 2021）。然而，上述许多方法依赖于相对苛刻的加工条件，所得结构在复杂环境条件下稳定性有限，从而限制了其实际应用。
近年来，酶促脱酰胺因其温和可控的特性而日益受到关注。蛋白谷氨酰胺酶（PG）介导的脱酰胺反应在蛋白分子中引入额外的负电荷，增强静电排斥并诱导部分分子展开（X. Chen et al., 2021; Fang, Xiang, Sun-Waterhouse, Cui, & Lin, 2020）。该过程有效地解聚紧密堆积的大豆蛋白聚集体，促进形成具有更高网络均匀性和连续性的光学透明水凝胶，从而为蛋白凝胶网络的理性设计提供了重要的结构基础（T. H. Li et al., 2024）。尽管脱酰胺反应在均匀性和透明度方面取得了显著改善，但大豆蛋白水凝胶仍存在凝胶强度不足、分子间连接松散和长期结构稳定性有限等问题。这一局限性源于PG主要调控蛋白构象和聚集，但未能在新重组网络中建立足够强的共价连接点。由于缺乏稳健的分子交联和网络强化，此类水凝胶无法满足质构工程食品、营养递送基质和功能生物材料等应用对机械性能和结构耐久性日益严格的要求。因此，开发有效策略以进一步强化脱酰胺大豆蛋白凝胶网络，弥合结构设计与实际机械性能之间的差距，仍是一项关键科学挑战。
微生物转谷氨酰胺酶（TGase）是一种酰基转移酶，可催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基团与赖氨酸残基的ε-氨基之间形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键，从而在蛋白分子内或分子间产生共价交联（Lai, Bao, Zhu, & Lin, 2022）。此外，TGase来源广泛、成本低廉，且被公认为食品安全（Mostafa, 2020）。因此，TGase可以为PG处理水凝胶中缺乏的共价强化提供支持。然而，其在天然大豆蛋白体系中的交联效率可能受到紧密蛋白聚集体限制反应性谷氨酰胺和赖氨酸残基可及性的影响。相比之下，PG诱导的聚集体解聚和分子展开可能暴露出这些反应位点，从而促进后续TGase介导的交联。然而，PG介导的结构重组是否能够促进后续TGase交联，同时保持网络均匀性、光学透明度和机械强度，目前仍缺乏充分的认识。为弥补这一研究空白，本研究提出了一种PG-TGase顺序酶促策略，即首先通过PG介导的脱酰胺反应解聚蛋白聚集体并提高反应位点的可及性，随后通过TGase催化的共价交联强化重组后的网络。本研究结合多种多尺度结构表征技术，包括原子力显微镜（AFM）、冷冻扫描电子显微镜（Cryo-SEM）、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、低场核磁共振（LF-NMR）和磁共振成像（MRI），以及流变学和力学分析，系统阐明了脱酰胺大豆蛋白水凝胶的结构演化和机械行为。本工作为蛋白质聚集和凝胶网络构建的顺序酶促调控提供了新的实验见解，并为高性能透明大豆蛋白水凝胶在食品和功能性材料体系中的应用奠定了理论基础。
