《Experimental Parasitology》：Digital PCR-based quantification of
Leishmania infantum in
Lutzomyia longipalpis: comparison between promastigote and macrophage-derived amastigote infection models
编辑推荐：
•数字PCR技术已被验证可用于白蛉中Leishmania infantum的定量检测。•无鞭毛体来源的感染产生的初始寄生虫负荷高于前鞭毛体。•显微镜检查和数字PCR一致地检测到经典的感染动力学。•数字PCR实现了对低寄生虫负荷的高灵敏度检测和绝对定量。•该方法为媒介传播能力和
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数字PCR技术已被验证可用于白蛉中Leishmania infantum的定量检测。
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无鞭毛体来源的感染产生的初始寄生虫负荷高于前鞭毛体。
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显微镜检查和数字PCR一致地检测到经典的感染动力学。
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数字PCR实现了对低寄生虫负荷的高灵敏度检测和绝对定量。
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该方法为媒介传播能力和传播研究提供了更多机遇。
引言
内脏利什曼病（VL）是最严重的被忽视热带病之一，在亚洲、非洲和拉丁美洲的流行地区造成高发病率和死亡率（Zhang et al., 2025）。在巴西，VL占美洲地区所有报告病例的90%以上，近几十年来，该病从农村向城市地区扩展，驱动因素包括无序城市化、森林砍伐和气候变化（PAHO, 2024; Borges et al., 2022）。近期研究表明，环境因素（包括温度、植被和土地利用）直接影响VL在全国范围内的空间分布（Gutiérrez et al., 2024）。
美洲地区VL的致病因子为Leishmania infantum，这是一种锥虫科原生动物，在脊椎动物宿主（尤其是家犬，主要储存宿主）和白蛉之间交替完成其生命周期（Serafim et al., 2020）。主要媒介为Lutzomyia longipalpis，其广泛的地理分布、较高的媒介传播能力及对人类环境的适应性增强了其流行病学意义（Rangel et al., 2018）。此外，近期在新流行区自然群体中检测到Lu. longipalpis体内的Leishmania DNA，进一步证实了其在维持和扩展传播循环中的作用（de Oca-Aguilar et al, 2023）。
在白蛉体内，吸血过程中摄入的无鞭毛体形态会转化为前鞭毛体，在中肠中增殖，随后分化为感染性前周期性形态，并向中肠前部和喙部迁移，从而使昆虫具有感染能力（Rogers, 2012）。Leishmania在白蛉体内的成功发育取决于一系列与媒介的复杂相互作用，包括适应中肠不断变化的理化条件、与消化酶及周膜基质的相互作用、以及与中肠上皮细胞的阶段性相互作用。这些过程调控寄生虫在媒介体内的存活、分化、增殖和迁移，涉及寄生虫来源的分子以及媒介的免疫和消化反应（Dostálová and Volf, 2012）。
传统上，感染动力学通过显微镜直接计数白蛉中肠中的寄生虫来评估，但该方法受限于灵敏度和重复性较低（Myskova et al., 2008）。近年来，PCR和定量PCR（qPCR）等分子技术改善了Leishmania在媒介和宿主中的检测和定量能力（Mota et al., 2022）。然而，qPCR依赖标准曲线，对低寄生虫负荷的检测准确性可能降低（Costa et. al., 2025）。数字PCR（dPCR）已成为一种强大工具，可在无需外部校准标准的情况下实现DNA绝对定量，提供卓越的灵敏度和精度。尽管dPCR已应用于人类（Ramírez et al., 2019）和犬类（Pereira et al., 2023）临床样本，但其在昆虫学研究中仍有限。
因此，本研究旨在利用数字PCR进行分子定量，评估实验感染前鞭毛体或无鞭毛体的Lu. longipalpis中Le. infantum感染的发育情况。使用两种发育形态旨在探究Le. infantum启动感染的阶段是否影响白蛉体内的寄生虫动力学，考虑到无鞭毛体是吸血时自然摄入的形态，而前鞭毛体常用于建立实验感染。通过随时间追踪寄生虫负荷，我们旨在比较无鞭毛体启动和前鞭毛体启动感染的早期和晚期动力学，并评估dPCR作为监测实验感染白蛉中Leishmania感染的灵敏定量方法的适用性。
章节摘要
Lutzomyia longipalpis种群
用于实验感染的Lu. longipalpis标本源自巴西巴伊亚州雅科比纳的已建立种群。该种群在帕拉纳联邦大学昆虫媒介与寄生虫实验室的昆虫饲养室中维护，遵循Lawyer et al.（2017）描述的饲养方案。白蛉在气候控制箱中标准化条件下饲养（26 ± 1 °C；相对湿度80%）。成虫标本接受棉片
结果
光学显微镜对Lu. longipalpis中肠中Le. infantum的定量显示，不同感染天数和寄生虫发育形态之间存在显著差异。在无鞭毛体感染组（A2、A5、A10）的雌虫中，感染后第2天寄生虫负荷最高，达到60.583 ± 8.462 寄生虫/μL（图2A）。第5天观察到寄生虫数量显著下降，接近基线水平。至第10天，感染部分恢复，寄生虫负荷
讨论
本研究利用两种感染模型（巨噬细胞来源的无鞭毛体与前鞭毛体）和两种定量方法（光学显微镜和dPCR），表征了Le. infantum在Lu. longipalpis中的感染动力学。这些方法的结合使得对白蛉肠道内寄生虫发育的详细时序分析成为可能。两种感染模型均表现出双相动力学模式，其特征为感染后第2天出现明显峰值，第5天显著下降，以及
结论
本研究证明，显微镜检查和数字PCR均可追踪Le. infantum在Lu. longipalpis中的经典感染动力学：吸血后初始峰值、排便时短暂清除以及第10天左右感染重建。无鞭毛体启动的感染产生更高的初始负荷，表明寄生虫的胞内递送可能更贴近自然传播过程。重要的是，dPCR提供了高灵敏度、绝对定量和
CRediT作者贡献声明
Daniela de Pita-Pereira：写作 – 审阅与编辑，可视化，研究。Gabriela Casani Cardoso：写作 – 初稿，方法论，研究，形式分析，数据管理。Francielly Maria Wilke Ramos Gos：写作 – 审阅与编辑，可视化，研究。Magda Ribeiro：写作 – 审阅与编辑，指导，资源，项目管理，方法论，概念化。Lucas Alexandre Farias de Souza：写作 – 初稿，可视化，方法论，
资助
本研究未获得任何来源的专项资助。CB为CNPq 2级人才：305001/2024-8。
Lucas Alexandre Farias de Souza|Gabriela Casani Cardoso|Francielly Maria Wilke Ramos Gos|Daniela de Pita-Pereira|Constan?a Britto|Edneia Amancio de Souza Ramos|Magda Clara Vieira da Costa-Ribeiro
