《Clinica Chimica Acta》：Extracellular vesicle–based diagnosis of Mucormycosis: Candidate biomarkers, analytical challenges, and clinical translation
编辑推荐：
•细胞外囊泡可能为毛霉病提供新的生物标志物。•目前关于毛霉目（Mucorales）细胞外囊泡的直接证据主要来自基于培养的研究。•CotH 家族蛋白、糖化酶（glucoamylase）以及毛霉蛋白酶（mucoricin）仍是候选靶标。•宿主来源的细胞外囊泡信号需要通过与其他鉴别
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细胞外囊泡可能为毛霉病提供新的生物标志物。
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目前关于毛霉目（Mucorales）细胞外囊泡的直接证据主要来自基于培养的研究。
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CotH 家族蛋白、糖化酶（glucoamylase）以及毛霉蛋白酶（mucoricin）仍是候选靶标。
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宿主来源的细胞外囊泡信号需要通过与其他鉴别诊断的对比加以验证。
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遵循 MISEV2023 规范的多组学研究以及多中心验证是必不可少的。
引言
毛霉病由属于毛霉目（Mucorales）的真菌引起，其中毛霉属（Rhizopus）、黏霉属（Mucor）和顶毛霉属（Lichtheimia）是常见的代表。该病伴有组织侵袭、血管血栓形成及坏死，死亡率较高，尤其是播散性感染以及在血液系统恶性肿瘤、器官移植、糖尿病控制不佳以及糖尿病酮症酸中毒患者中 [1], [2]。印度与 COVID-19 相关的毛霉病暴发也凸显了高血糖、大剂量糖皮质激素使用、铁代谢紊乱以及诊断延迟之间的相互作用 [3], [4]。抗真菌治疗和外科评估的延迟与预后不佳相关；因此，迫切需要一种可针对易于获取的体液进行的快速确诊性检测。
迄今为止，毛霉病的诊断依赖于临床和影像学特征相符，并结合显微镜检查、组织病理学、培养和/或分子检测。在组织受破坏或治疗前，培养可能呈阴性；而组织病理学需要组织样本，且不一定能够在属水平上进行区分 [5], [6]。目前没有毛霉病的常规血清学检测，且 β-D-葡聚糖（β-D-glucan）和曲霉半乳甘露聚糖（Aspergillus galactomannan）检测无法检出毛霉目真菌；因此，这些检测所得的真正阴性结果并不能排除毛霉病 [7], [8], [9]。一项荟萃分析证实了毛霉目 PCR 的潜力；尽管已有一种名为 MucorGenius 的商品化 qPCR 试剂可用于呼吸道和活检标本，但其可及性、经过验证的标本类型、当地监管状况以及实验室基础设施均存在差异 [10], [11]。目前没有常规的毛霉目血清学、抗原或细胞外囊泡（EV）检测。
细胞外囊泡（EV）的优势在于其能够保存低丰度的 RNA、DNA 和蛋白质，并能够在测量前捕获病原体或宿主的表面成分并富集其亚群 [12], [13]。MISEV2023 制定了关于分离方法描述、颗粒身份证据、非囊泡性污染物以及功能声称的术语 [14]。关于毛霉目的直接证据仍然有限：葡萄牙黏霉（M. lusitanicus）细胞外囊泡已通过蛋白质组学进行了表征，而地霉（R. delemar）培养上清液组分中含有多种细胞外小 RNA [15], [16]。尽管在其他人真菌病中关于人体生物流体细胞外囊泡的研究颇具前景，但它们无法取代毛霉病中患者层面的证据需求 [17]。因此，本综述并未将细胞外囊泡检测视为临床可用的检测方法，而是将其视为一种可检验的转化医学假说。
章节摘要
文献检索方法
本次修订检索了从数据库建立至 2026 年 5 月的 PubMed/MEDLINE 数据库，并进行了回溯引文核查以及对主要原始研究的被引筛选。检索词包括"毛霉病"或毛霉目各个属名，与"细胞外囊泡"、"外泌体"、"细胞外 RNA"、"生物标志物"、"PCR"、"抗原"、"蛋白质组学"、"诊断"、"校准剂"以及平台术语如"生物样本库"组合检索。记录首先进行相关性初筛，然后对全文进行评估：原始文献
细胞外囊泡生物学：具有临床相关性的基础
细胞外囊泡（EV）是由细胞释放的脂双层颗粒。将其归入内体或质膜生物发生途径，不应仅依据其大小来判断。这对诊断研究的主要影响是异质性：单纯的颗粒总数不足以提供关于细胞来源的信息，而经典哺乳动物四跨膜蛋白（tetraspanins）的存在也不能证明所捕获的颗粒来源于真菌。
真菌细胞外囊泡能够转运
真菌细胞外囊泡货物：蛋白质、脂质和核酸
在新孢霉（C. neoformans）中的初步工作揭示了囊泡中致病菌相关蛋白质和酶活性的存在；在组织胞浆菌（Histoplasma）和念珠菌（Candida）中则显示出 RNA 装载以及形态型依赖性的细胞外囊泡蛋白质组 [25], [26], [27]。此外，对不同隐球菌（Cryptococcus）物种的冷冻电子显微镜观察和蛋白质组学研究揭示了具有结构的囊泡表面以及保守蛋白，这些蛋白可能有助于跨物种捕获策略 [28]。这些研究提供了分析上的可行性，但
毛霉病发病机制与细胞外囊泡生物标志物的合理性
物种特异性的细胞壁多糖会引起不同的炎症反应；CotH3 与 GRP78 的结合以及 CotH7 与整合素 β1（integrin β1）的结合对于鼻眶型和肺型侵袭具有重要意义 [32], [33]。毛霉目真菌能够抑制巨噬细胞的 nitric oxide（一氧化氮）产生，并分泌免疫调节性蛋白质 [34], [35]。血清 GRP78 水平与 COVID-19 相关毛霉病相关；地霉特异性糖化酶已被鉴定为一种血清学诊断试剂 [36], [37]。抗体
蛋白质、抗原和分子生物标志物
一种 23 kDa 的地霉特异性抗原在豚鼠模型中于组织病理学诊断之前被检出，且地霉特异性糖化酶在患者血清学队列中显示出诊断价值 [37], [42]。TG11 单克隆抗体对毛霉目细胞外多糖具有特异性，并已开发为侧向流动（lateral-flow）形式，用于评估支气管肺泡灌洗液中该设备的灵敏度和特异度；然而，结果并不理想，因此需要进一步
分离与富集
细胞外囊泡分离方法在回收率和纯度之间是一种折衷。差异超速离心常用于真菌培养上清液，但蛋白质聚集体和脂蛋白可能被共同沉淀。血浆纯度可通过尺寸排阻色谱（size-exclusion chromatography）提高，而串联尺寸排阻与密度梯度超速离心可进一步减少污染物 [25], [54], [55]。为了比较临床性能，至少需要一种高回收率方法和一种高特异性
细胞外囊泡检测是否在其他疾病中通过了诊断严格性检验？
一种三基因逆转录 PCR 评分已在 22 个社区和学术中心、共 1064 名男性中锁定并得到验证，用于创建针对高级别前列腺癌的尿液外泌体基因表达检测，其判别能力优于标准临床变量 [60]。迄今为止，尚无任何毛霉病的细胞外囊泡检测通过独立验证、被证明具有临床价值或获监管机构广泛接受。
患者来源的多组学发现流程
发现性研究应在……的情况下，以前瞻性（PROSPECTIVE）方式连续入组患者
罕见病的多中心生物样本库
由于毛霉病的罕见性和临床紧迫性，组建单一且样本量足够的队列是不可行的。因此应采用统一的病例报告表和前瞻性哨点网络的标准操作程序，在基线和治疗过程中连续保存配对的血浆、血清、支气管肺泡灌洗液、组织、提取的核酸以及培养分离株。元数据要求包括采集时间与抗真菌治疗及外科手术的时间关系，
结论与未来展望
在某些情境下，商品化毛霉目 PCR 是可获得的；然而，其可及性和标准化程度仍然有限。目前，通过培养来源的地霉（R. delemar）细胞外 RNA 和葡萄牙黏霉（M. lusitanicus）细胞外囊泡蛋白质组学，已为直接发现工作奠定基础；来自其他疾病的证据表明，细胞外囊泡富集检测能够通过多中心诊断验证。初步的重点应放在识别那些在……中得到可重复保护的独立真菌 RNA/DNA/蛋白质靶标上
CRediT 作者贡献声明
Obaid Afzal：形式化分析、概念化。Ali Altharawi：软件、数据整理。Mubarak A. Alamri：指导、调查研究。Manal A. Alossaimi：撰写——审阅与编辑、可视化。Abdulmalik S.A. Altamimi：撰写——原始文稿、概念化。Alhumaidi Alabbas：撰写——原始文稿、数据整理。Safar M. Alqahtani：可视化、调查研究。Surya Nath Pandey：指导、项目管理。A. Rekha：撰写——原始文稿、软件。Rajat Sharma：
资金支持
本研究获得了沙特法塔姆王子（Prince Sattam bin Abdulaziz）大学的资金支持（项目编号：PSAU/2026/03/44689）。
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。在撰写本文的过程中，作者仅使用生成式人工智能（Generative AI）和人工智能辅助工具来改进稿件的语言、语法和可读性。未使用任何人工智能工具生成实质性内容、执行数据分析、解释结果或得出科学结论。
致谢
作者感谢沙特法塔姆王子（Prince Sattam bin Abdulaziz）大学通过项目编号（PSAU/2026/03/44689）对本研究提供的资金支持。
Obaid Afzal|Ali Altharawi|Mubarak A. Alamri|Manal A. Alossaimi|Abdulmalik S.A. Altamimi|Alhumaidi Alabbas|Safar M. Alqahtani|Surya Nath Pandey|A. Rekha|Rajat Sharma
