外周GALR2激活介导代谢稳定型spexin类似物LIT-01-144产生强效且不依赖阿片受体的镇痛作用

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Peripheral GALR2 activation by the metabolically stabilized spexin analog LIT-01-144 produces potent opioid?independent antinociception

　　

慢性疼痛是临床和社会经济影响最严重的疾病之一。约20%的美国成年人经历慢性疼痛，欧洲亦有25%–35%的成年人受影响。阿片类镇痛药尽管存在便秘、恶心、镇静、呼吸抑制、耐受和依赖等多种不良反应，仍是疼痛管理的金标准，其中耐受、依赖和呼吸抑制尤为令人担忧，因为它们导致阿片类药物滥用、自行处方、过量使用乃至死亡，凸显了开发新治疗策略的迫切性。 甘丙肽受体（galanin receptor, GALR）家族是由三种G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor, GPCR）组成的亚群，可与内源性肽甘丙肽结合，参与摄食、能量稳态、渗透调节、水摄入和疼痛等多种功能的调控。尽管已有大量研究，但由于缺乏选择性激动剂或拮抗剂，每种受体在疼痛调控中的确切作用仍不清楚。GALR1是分布最广泛的受体，广泛分布于中枢神经系统和外周神经系统，包括脊髓背角和背根神经节（dorsal root ganglion, DRG），并已被证明具有镇痛特性。GALR2主要在大脑和DRG中表达，其对伤害性感受调控的贡献复杂且存在争议，文献中既有促伤害性效应也有抗伤害性效应的报道。GALR3因表达水平较低而研究较少。 近期，通过生物信息学分析发现了一种新的内源性神经肽spexin（又称神经肽Q），并进一步证明其可选择性激活GALR2/R3而非GALR1。脑室内（intracerebroventricular, icv）给予spexin可在 na?ve 小鼠中诱导热镇痛效应，该效应不被阿片拮抗剂纳曲酮阻断。然而，spexin在外周疼痛调控中的确切作用及其与GALR2/R3的相互作用仍不清楚。 在本研究中，研究人员描述了一种源自spexin的新型药理学工具LIT-01-144的设计、合成和表征，用以研究GALR2/R3在体内的作用。该化合物与spexin相比，表现出改善的代谢稳定性和对GALR2/R3的激动活性，同时保留了对GALR1同样极低的亲和力。在持续性炎症疼痛小鼠中，LIT-01-144在外周给药后，以比spexin低10–100倍的剂量表现出镇痛活性。该活性与DRG中表达Galr2的神经元数量增加相关，且不依赖GALR3和阿片受体。这些结果为spexin和GALR2以不依赖阿片的方式调控伤害性感受提供了证据，进一步凸显了靶向GALR2的化合物在疼痛管理中的治疗潜力。

论文解读：代谢稳定型spexin类似物LIT-01-144通过外周GALR2激活产生非阿片类镇痛作用

一、研究背景与科学问题

慢性疼痛是临床和社会经济影响最严重的疾病之一，约20%的美国成人和25%–35%的欧洲成年人受其困扰。阿片类镇痛药目前仍是疼痛管理的金标准，但伴随便秘、恶心、镇静、呼吸抑制、耐受和依赖等多种不良反应，其中耐受、依赖和呼吸抑制尤为严重，可导致阿片类药物滥用、过量使用乃至死亡，因此亟需开发新型非阿片类镇痛策略。

甘丙肽受体（GALR）家族包含三种G蛋白偶联受体（GPCR），参与摄食、能量稳态和疼痛等多种生理功能的调控。然而，由于缺乏选择性激动剂或拮抗剂，各受体亚型在疼痛调控中的确切作用长期不明。GALR1已被证实具有镇痛特性；GALR2的贡献则存在争议，既有研究报道其促伤害性效应，也有研究显示其抗伤害性作用；GALR3因表达水平低而研究较少。新发现的内源性神经肽spexin可选择性激活GALR2/R3而非GALR1，脑室内给药可产生不被纳曲酮阻断的热镇痛效应。但spexin在外周疼痛调控中的确切作用及其与GALR2/R3的相互作用仍不清楚，且spexin本身代谢稳定性差，限制了其体内研究应用。因此，开发代谢稳定的spexin衍生物以阐明GALR2/R3在外周疼痛调控中的作用，具有重要的科学意义和治疗转化价值。

二、研究内容与主要结论

研究人员设计并合成了两种在spexin序列的N端或C端引入氟碳链（FC）的衍生物LIT-01-144和LIT-01-128，系统表征了其体外活性、代谢稳定性和药代动力学特征，并在na?ve小鼠和完全弗氏佐剂（CFA）诱导的持续性炎症疼痛小鼠中评估了其镇痛活性。研究得出以下主要结论：LIT-01-144是代谢稳定的GALR2/R3选择性激动剂，对GALR1几乎无活性；外周给药后在炎症疼痛小鼠中产生剂量依赖的强效镇痛作用，该作用由GALR2介导且不依赖阿片受体；炎症状态下DRG中Galr2阳性神经元数量显著增加，解释了LIT-01-144在炎症而非na?ve动物中的外周镇痛活性；重复给药可产生类似阿片类的镇痛耐受。该研究确立了GALR2作为非阿片类镇痛药开发的重要外周靶点。

三、关键技术方法

研究人员采用固相Fmoc/tBu肽合成法合成氟化spexin衍生物，通过半制备反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化并用LC-MS鉴定。体外活性评估使用HEK293细胞系：在稳定表达GALR1的细胞中通过Glosensor cAMP积累实验测定cAMP抑制活性，在稳定表达GALR2及瞬时表达GALR3的细胞中通过钙动员实验测定激动活性。代谢稳定性通过小鼠血浆孵育实验评估半衰期。药代动力学研究在CD1小鼠中进行，腹腔注射（ip）10 mg/kg后不同时间点采血，UPLC-MS/MS定量分析血浆浓度。脑内浓度测定在C57BL/6N小鼠中进行。疼痛行为学评估采用尾浸试验（TIT）和尾压试验（TPT）。炎症疼痛模型通过在C57BL/6N雄性小鼠尾部皮下注射CFA诱导。DRG中Galr2表达通过RNAscope荧光原位杂交（ISH）检测，并利用公开的单细胞RNA测序（scRNA-seq）图谱分析Galr2在DRG神经元亚群中的分布。

四、研究结果

4.1 新型spexin偶联物的设计、合成与功能评价

研究人员将氟碳链引入spexin的C端或N端，分别得到LIT-01-128和LIT-01-144。体外功能实验表明，与spexin类似，两种衍生物对GALR1几乎无激动活性（EC₅₀ > 10 000 nM），而对GALR2和GALR3均表现出完全激动活性。其中LIT-01-144在GALR2和GALR3上的EC₅₀分别为4.2 ± 0.9 nM和3.2 ± 0.7 nM，比内源spexin（分别为53 ± 5 nM和37 ± 9 nM）低约10倍，表明N端是引入FC修饰的最佳位置。

4.2 spexin和LIT-01-144的药代动力学评价

体外血浆稳定性实验显示，LIT-01-144在小鼠血浆中的半衰期为432 ± 6 min，比spexin（65 ± 12 min）提高约7倍。腹腔注射10 mg/kg后，LIT-01-144的体内半衰期为101 ± 7 min，比spexin（5.1 ± 1.7 min）高约20倍，暴露量（AUC）约为spexin的45倍。两种化合物的吸收相似，C_max分别为0.20 ± 0.02 nmol/ml和0.13 ± 0.05 nmol/ml。脑内浓度测定显示，给药后5、30和360 min均未在小鼠脑中检测到spexin和LIT-01-144，表明两者均不能穿过血脑屏障。

4.3 na?ve小鼠中spexin和LIT-01-144经脑室内和全身给药后的镇痛活性

脑室内（icv）给药实验中，spexin剂量依赖性地提高小鼠热伤害性阈值，LIT-01-144在0.1和1 nmol剂量下即产生显著镇痛反应，有效剂量比spexin低10–100倍。腹腔注射2和20 mg/kg后，两种化合物在na?ve小鼠中均未对热和机械伤害性阈值产生显著影响，表明在无痛状态下激活外周GALR2/R3不产生预防性镇痛作用。

4.4 炎症疼痛小鼠中外周给药的镇痛活性

在CFA诱导的持续性炎症疼痛小鼠中（痛觉过敏最严重的第2或3天），spexin（20 mg/kg）和LIT-01-144（20和2 mg/kg）腹腔给药均产生显著镇痛作用，LIT-01-144在比spexin低10倍的剂量下即有效。使用GALR3选择性拮抗剂SNAP-37889预处理不影响LIT-01-144的镇痛活性，表明该效应由GALR2介导而非GALR3。

4.5 na?ve和炎症小鼠DRG中Galr2转录本的分布

荧光原位杂交（ISH）结果显示，na?ve小鼠DRG中Galr2阳性细胞数量极少，而CFA炎症小鼠DRG中Galr2阳性细胞数量显著增加，且与神经元标志物NeuN共标，表明Galr2 mRNA主要表达于DRG神经元。利用公开的scRNA-seq图谱分析发现，na?ve小鼠DRG中Galr2主要表达于伤害性感受器，包括肽能（Calca阳性）和非肽能（Mrgprd阳性）C纤维神经元的一小部分。

4.6 LIT-01-144镇痛活性的阿片依赖性

在CFA炎症小鼠中，阿片受体拮抗剂纳曲酮（1 mg/kg，皮下注射）预处理不影响LIT-01-144（2 mg/kg，ip）的镇痛作用，表明GALR2介导的镇痛反应独立于阿片系统。

4.7 LIT-01-144重复给药后镇痛耐受的发展

在CFA小鼠中于第2、7、12和17天重复腹腔注射LIT-01-144（2 mg/kg）。第2天首次给药产生持续至少6小时的显著镇痛效应，第7天第二次给药产生类似效应，第12天第三次给药的镇痛幅度降低，第17天最后一次给药未观察到显著镇痛。所有动物在第30天恢复基础伤害性阈值。这些结果表明，与阿片类药物类似，重复激活GALR2可诱导镇痛耐受。

五、讨论与结论

讨论部分指出，氟碳链修饰策略成功应用于spexin，在不改变GALR1选择性的前提下，不仅未干扰肽与GALR2/R3的相互作用，还将LIT-01-144在GALR2和GALR3上的功能活性提高了约10倍，同时显著改善了体内外代谢稳定性。该研究是氟碳链修饰同时增强神经肽体内外活性的首个成功范例。LIT-01-144作为高选择性GALR2/R3配体，其外周镇痛活性不被GALR3拮抗剂SNAP-37889和阿片拮抗剂纳曲酮阻断，为GALR2及其内源配体构成独立于阿片系统的 bona fide 镇痛系统提供了新证据。炎症小鼠DRG中Galr2阳性神经元显著增加，与LIT-01-144在炎症而非na?ve动物中的外周镇痛活性一致，提示GALR2可作为慢性疼痛治疗的潜在靶点。

研究结论部分指出，该研究连同先前在apelin上的工作，凸显了将氟化碳引入肽序列作为从内源肽开发新型药理学工具策略的潜力。通过该方法开发的spexin类似物LIT-01-144提供了支持GALR2在持续性疼痛中发挥外周镇痛作用的新证据，将GALR2确立为开发慢性炎症性疼痛新型镇痛药的有前景靶点。LIT-01-144也可能在神经病理性疼痛治疗中具有应用价值，因为神经病理性疼痛中阿片疗效存在争议而GALR2表达上调。研究局限性包括：仅使用雄性小鼠，需在雌性中验证；未评估更高剂量在无痛动物中的效应；所有实验均在鼠类炎症疼痛模型中进行，向人类的转化相关性尚待确立；该氟化肽的毒性和安全性尚未评估，氟碳基序的药物开发适用性仍需专门的毒理学评价。