高亲和力、构象表位特异性抗EpCAM #126-MMAE抗体–药物偶联物的开发及其对EpCAM阳性结直肠癌的临床前评价

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Development and preclinical characterization of an MMAE-conjugated anti-EpCAM antibody–drug conjugate for colorectal cancer

　　

上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）在结直肠癌（colorectal cancer, CRC）中频繁过表达，因此是有吸引力的治疗靶点。然而，靶向EpCAM抗体的临床疗效受限于次优结合特性和对免疫效应机制的依赖。在此，研究人员描述了抗EpCAM #126（anti-EpCAM #126）——一种从OPAL噬菌体展示库中分离的全人源单克隆抗体——及其相应抗体–药物偶联物（antibody–drug conjugate, ADC）的开发与表征。抗EpCAM #126比adecatumumab表现出显著更高的结合亲和力，主要归因于显著更低的解离速率。高密度肽微阵列分析和丙氨酸扫描诱变鉴定出EpCAM胞外域内NGSKLGRRAK（残基74–83）为主要表位，其中S76、R81和K83为关键接触残基。结合是构象依赖性的，并在胰蛋白酶介导的表位区域蛋白水解切割后显著降低。抗EpCAM #126对CRC异种移植和患者来源肿瘤组织表现出稳健染色，并在人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）和小鼠模型中表现出低细胞因子释放。在确认有效受体介导内化后，抗EpCAM #126通过蛋白酶可裂解缬氨酸–丙氨酸连接子与单甲基澳瑞他汀E（monomethyl auristatin E, MMAE）偶联，生成平均药物–抗体比（drug-to-antibody ratio, DAR）受控为4.31且保留纳摩尔级EpCAM结合亲和力的ADC。所得ADC对表达EpCAM的CRC细胞系表现出强效细胞毒性，并在患者来源异种移植（patient-derived xenograft, PDX）模型中于10 mg/kg剂量下实现84.96%肿瘤生长抑制，而未偶联抗体无抗肿瘤活性。这些发现表明，抗EpCAM #126-MMAE是一种高亲和力、表位特异性ADC，对EpCAM阳性CRC具有有前景的临床前疗效。

该研究由Hae Li Ko、Qui Ngoc Sang Nguyen、Si-Eun Baek、Dong-Beom Kim、Young-Heon Park、Se-Hyun Kim、Yong Bhum Song、Deok-Hoon Kong、Wook-Bin Lee、Sang Hoon Jung、Jae Wook Lee、Sungjin Lee等研究人员开展。结直肠癌（colorectal cancer, CRC；一种常见消化道恶性肿瘤）仍是全球癌症相关发病和死亡的主要原因之一，晚期患者有效治疗选择有限。上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM；CD326，一种30–40 kDa的I型跨膜糖蛋白）在CRC及多种上皮恶性肿瘤中持续过表达，而在多数正常成人上皮中表达相对受限。其高表达与晚期肿瘤阶段、淋巴结转移和不良临床结局相关，且不受KRAS突变状态影响；CRC中约40%患者存在KRAS突变，并导致对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）靶向治疗耐药。既往EpCAM靶向抗体，包括edrecolomab、catumaxomab和adecatumumab，虽进入临床评价并具有一定安全性，但临床获益有限，原因涉及依赖抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性等免疫效应机制，以及结合亲和力、靶标结合和肿瘤穿透方面的限制。抗体–药物偶联物（antibody–drug conjugate, ADC；通过连接子将肿瘤选择性抗体与强效细胞毒载荷偶联的靶向药物）可在抗原结合和内化后选择性递送细胞毒药物。单甲基澳瑞他汀E（monomethyl auristatin E, MMAE；一种微管破坏性auristatin载荷）是常用载荷之一，常通过蛋白酶可裂解缬氨酸–丙氨酸或缬氨酸–瓜氨酸连接子偶联。尽管EpCAM适合ADC靶向，但尚无EpCAM导向ADC获批。因此，研究人员从OPAL噬菌体展示单链可变片段库中分离全人源抗EpCAM #126，表征其结合动力学、表位特异性、组织分布和受体介导内化，并制备MMAE偶联ADC，在EpCAM阳性CRC模型中进行临床前评价。研究结论提示，抗EpCAM #126-MMAE是一种高亲和力、表位特异性ADC，在EpCAM阳性CRC中具有有前景的临床前疗效，并可能将治疗机制从依赖免疫效应转向抗原导向的直接细胞毒性。

为开展研究，研究人员采用的主要关键技术方法包括：OPAL人合成单链可变片段噬菌体展示库（由Ewha Womans University提供）经三轮生物淘选筛选抗体，二代测序鉴定候选克隆并重组成人IgG1；ELISA、流式细胞术、生物层干涉（bio-layer interferometry, BLI）和表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）评价结合与动力学；高密度肽微阵列、丙氨酸扫描诱变和胰蛋白酶消化进行表位定位；pH响应荧光评估受体介导内化；通过缬氨酸–丙氨酸连接子偶联MMAE并以完整质量液相色谱–质谱测定药物–抗体比（drug-to-antibody ratio, DAR）；细胞活力检测；从11个CRC PDX模型中筛选出EpCAM高表达的CO-46模型进行体内疗效与TUNEL检测；DyLight 755标记抗体进行体内生物分布成像；人健康供者PBMCs及小鼠进行细胞因子释放评估，并进行序列基免疫原性预测。

研究结果如下。2.1 抗EpCAM #66和#126表现出增强结合活性、靶标特异性和良好临床前特性：研究人员通过三轮生物淘选分离400个scFv克隆，经二代测序获得11个候选抗体，重组成人IgG1后以ELISA筛选，发现抗EpCAM #66和#126结合信号最强且对牛血清白蛋白反应最低；浓度–反应ELISA中二者半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀）分别为0.32和0.25 nM，而adecatumumab为6.12 nM。流式细胞术显示二者结合HCT116细胞，抗EpCAM #126对EpCAM阴性Raji细胞无结合，而#66和adecatumumab有轻度非特异结合；siRNA敲低EpCAM降低三者结合，支持抗原依赖性识别。免疫荧光中，抗EpCAM #126、#66和adecatumumab均与E-cadherin在细胞外周共定位；抗EpCAM #126在PDX组织中染色强且背景低。DyLight 755标记抗EpCAM #126在HCT116异种移植小鼠中自8 h至48 h显示肿瘤蓄积，离体成像显示肿瘤和肝有强信号，其他主要器官信号低。细胞因子释放方面，抗EpCAM #126未在人PBMCs或小鼠血清中显著增加TNF-α或IFN-γ，adecatumumab在人PBMCs中轻度增加TNF-α。序列基免疫原性预测显示，抗EpCAM #126的生殖系过滤后表位负荷为每100 aa每等位基因0.11，位于全人源/人源化抗体范围，且低于adalimumab、trastuzumab和ustekinumab，仅adecatumumab更低；残余预测表位均位于互补决定区（complementarity-determining region, CDR）。结论：抗EpCAM #126具有高特异性、良好肿瘤组织识别、体内肿瘤靶向和低细胞因子释放特性。

2.2 抗EpCAM #126表现出高亲和力结合和慢解离动力学：BLI测定显示，抗EpCAM #66的K_D为2.7 nM（k_on=1.6×10⁶ M^?1·s^?1；k_off=4.5×10^?3 s^?1），抗EpCAM #126的K_D为3.08 nM（k_on=1.77×10⁵ M^?1·s^?1；k_off=5.3×10^?4 s^?1），其解离速率比#66低约8.5倍；adecatumumab的K_D约为15.6 nM（k_on=1.5×10⁵ M^?1·s^?1；k_off=2.3×10^?2 s^?1），亲和力较弱且解离更快。人IgG1同型对照无可测结合。结论：抗EpCAM #126兼具高亲和力和显著更慢的解离动力学，因此被选为后续机制和临床前研究对象。

2.3 表位定位揭示抗EpCAM #126对保守EpCAM表位的构象识别：高密度肽微阵列覆盖约70,000条重叠15肽，含NGSKLGRRAK（残基74–83）的肽产生最高荧光信号，最高强度肽VVIAVVANGSKLGRR达16,741。AlphaFold预测结构显示该表位位于EpCAM胞外域表面暴露环。丙氨酸扫描中S76A、R81A和K83A导致最大结合信号下降，提示S76、R81和K83为主要接触残基。胰蛋白酶处理显著降低抗EpCAM #126与HCT116细胞结合，而accutase处理基本不影响；adecatumumab在两种处理下均保留结合。TPCK-胰蛋白酶消化重组EpCAM后，抗EpCAM #126不能识别约10 kDa切割产物，而323/A3和adecatumumab仍可识别。人EpCAM和小鼠EpCAM在该区域约60%一致，S76、K77、G79、R80、R81和K83保守；ELISA显示抗EpCAM #126结合人、鼠EpCAM，adecatumumab仅结合人EpCAM；流式显示抗EpCAM #126结合4T1和MC38细胞表面天然鼠EpCAM，但弱于抗鼠EpCAM克隆G8.8，adecatumumab无结合。结论：抗EpCAM #126识别构象依赖的保守表位，并具有小鼠EpCAM交叉反应性。

2.4 抗EpCAM #126-MMAE具有受控药物–抗体比并保留高亲和力EpCAM结合：pH响应荧光显示抗EpCAM #126在EpCAM表达细胞中有效受体介导内化，F(ab')₂对照摄取低，adecatumumab作为阳性对照表现类似内化。研究人员通过蛋白酶可裂解缬氨酸–丙氨酸连接子将MMAE偶联至抗EpCAM #126，完整质量液相色谱–质谱显示重链DAR0–DAR3种质量峰，未检测到载药轻链，平均DAR为4.31。SPR显示未偶联抗EpCAM #126的K_D为2.827×10^?10 M，ADC的K_D为1.061×10^?9 M；偶联后亲和力约降低3.75倍，但仍保留纳摩尔级EpCAM结合。结论：抗EpCAM #126-MMAE具有受控DAR，并保留高亲和力抗原结合，适合进一步治疗性ADC评价。

2.5 抗EpCAM #126-MMAE在EpCAM阳性CRC模型中表现出强效细胞毒和抗肿瘤活性：细胞活力实验显示，抗EpCAM #126-MMAE在HCT116和SW48中IC₅₀分别为1.93和2.12 nM，未偶联抗体几乎无细胞毒作用，游离MMAE强效；在EpCAM阳性OVCAR-3中IC₅₀为1.271 nM，而未偶联抗体无影响；EpCAM阴性CCD-18Co细胞中ADC不降低活力，但游离MMAE仍敏感，说明细胞毒依赖EpCAM表达。体内采用CO-46 EpCAM阳性CRC PDX模型，每周静脉给药6周。10 mg/kg抗EpCAM #126-MMAE相对vehicle的肿瘤生长抑制（tumor growth inhibition, TGI）为84.96%，平均肿瘤体积101.95±84.77 mm³；1 mg/kg的TGI为35.7%。未偶联抗EpCAM #126在1或10 mg/kg均无抗肿瘤活性。10 mg/kg组肿瘤重量为0.06±0.06 g，低于vehicle等组。10 mg/kg组给药后出现短暂体重下降并恢复，1只动物于第35天死亡，尸检未发现可解释死亡的宏观异常。TUNEL显示10 mg/kg组肿瘤组织凋亡信号显著增加，1 mg/kg组也有增加，未偶联抗体有轻微凋亡增加。结论：抗EpCAM #126-MMAE在EpCAM阳性CRC中产生强效、剂量依赖、载荷驱动的抗肿瘤活性，而未偶联抗体活性有限。

讨论部分总结：研究人员指出，抗EpCAM #126从OPAL噬菌体展示单链可变片段库中分离，兼具高亲和力、构象依赖性抗原识别和有效受体介导内化，适合作靶向载荷递送支架。其结合亲和力约比adecatumumab高5倍，主要由于更低k_off，可能延长靶标占据并有利于内化。偶联MMAE后ADC仍保留高亲和力EpCAM结合。表位NGSKLGRRAK位于表面暴露环，S76、R81和K83为关键接触残基，胰蛋白酶切割破坏识别，支持构象依赖表位；该表位在人与鼠EpCAM间部分保守，使同一抗体可在小鼠模型中评价，但也限制鼠源安全性数据对人类靶向/脱靶毒性的预测。抗EpCAM #126内化进入酸性内体/溶酶体，适合缬氨酸–丙氨酸连接子裂解释放MMAE。体内成像显示肿瘤蓄积，正常器官主要肝信号。MMAE选择、DAR 4.31和缬氨酸–丙氨酸连接子参考已批准auristatin ADC设计。ADC在KRAS突变HCT116和KRAS野生型SW48中均强效，提示细胞毒不受KRAS状态影响；在PDX中10 mg/kg达84.96% TGI，而未偶联抗体无显著活性，支持EpCAM导向MMAE递送机制。讨论也承认局限：仅单一PDX、免疫缺陷小鼠、无EpCAM阴性体内对照；未进行高分辨结构解析；抗EpCAM #126对鼠EpCAM结合弱于鼠特异性抗体，限制安全性解释；需专门组织交叉反应、非人灵长类重复给药毒理、游离MMAE释放、药代、瘤内载荷分布和实验性免疫原性评价；疗效在较低肿瘤负荷下获得，且未直接评估瘤内穿透和结合位点屏障。研究结论翻译：该研究设计为概念验证性研究，旨在确定抗EpCAM #126——一种结合高亲和力、构象依赖性表位和有效受体介导内化的抗体——能否转化为功能性MMAE基ADC，在体内具有靶标特异性细胞毒性和抗肿瘤活性。所呈数据共同支持这一概念验证：抗EpCAM #126在多个正交试验和细胞环境中表现出对EpCAM的特异性高亲和力结合，以受控平均DAR 4.31与MMAE偶联且未检测到轻链载药，所得ADC在体外产生强效、载荷依赖性细胞毒性，并在体内产生显著肿瘤生长抑制（10 mg/kg下84.96%）伴TUNEL确认的凋亡。总之，这些发现从功能上验证了ADC的核心机制前提：抗原特异性结合、受控偶联和载荷驱动细胞毒性。