《Biosensors and Bioelectronics》：Sample-to-answer on-farm raw milk quality evaluation via a portable chip-based high-accuracy somatic cell counting system
编辑推荐：
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一种便携式的样本处理系统能够在5分钟内完成农场现场的乳腺炎（SCC）预筛查，所需耗材成本低于0.50美元。
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一种便携式的样本处理系统能够在5分钟内完成农场现场的乳腺炎（SCC）预筛查，所需耗材成本低于0.50美元。
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预装试剂的微流控芯片可实现片上荧光染色，无需额外试剂或设备。
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固定荧光成像和自动多区域采集技术提高了标准化程度，减少了操作者的差异性。
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基于区域的计数方法在广泛的浓度范围内以及接近阈值的浓度范围内提高了SCC测量的准确性。
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实际样本验证显示，该系统在乳腺炎风险和牛奶质量预筛查方面的结果与中心化检测相当。
引言
乳腺炎是奶牛养殖中最具破坏性、成本最高且最难预防的疾病之一，直接影响原奶质量和农场盈利能力，其形式包括临床型和亚临床型（Puerto等，2021年；Rasmussen等，2024年）。临床型乳腺炎通常表现为乳房可见炎症、牛奶异常或全身症状，因此相对容易检测（Ruegg，2017年；Wollowski等，2019年）。相比之下，亚临床型乳腺炎没有明显的外部体征，但会持续增加牛奶中的体细胞计数，改变牛奶成分，降低牛奶产量，并影响原奶质量（Ruegg，2017年）。先前的研究表明，乳腺炎通过减少牛奶产量、增加治疗成本、处理过程中丢弃牛奶、提高淘汰风险以及降低牛奶市场价值等方式造成重大经济损失（Aghamohammadi等，2018年；Dejyong等，2022年；Halasa等，2007年；Hogeveen等，2011年）。最近的全球经济建模进一步估计，临床型和亚临床型乳腺炎每年分别造成约130亿美元和90亿美元的损失（Rasmussen等，2024年）。在这些损失中，牛奶产量减少通常被视为主要成本因素（Aghamohammadi等，2018年）。因此，开发一种快速的农场现场乳腺炎风险筛查方法对于早期评估乳房健康、分娩前牛奶质量控制以及减少农场层面的经济损失至关重要。
牛奶中的体细胞计数（SCC）是连接奶牛乳房健康评估和原奶质量控制的关键指标（Li等，2014年；Ruegg，2017年）。SCC升高通常反映了乳腺组织的炎症反应增强，可用于临床型和亚临床型乳腺炎的风险筛查；同时，SCC也与原奶卫生状况、牛奶成分变化、适合乳制品加工的程度以及牛奶污染风险密切相关（Li等，2014年；Martin等，2023年；Ruegg，2017年；Smith等，2001年）。国家乳腺炎委员会指出，SCC被广泛用于评估乳房和奶牛的整体健康状况、牛奶的适合程度以及与乳腺炎相关的经济损失。SCC升高还与乳腺内感染风险、原奶微生物质量下降、牛奶成分改变、适合乳制品加工的程度降低以及对抗菌药物使用和残留物控制的压力增加有关（Gonzalo等，2010年；Ma等，2000年；Martin等，2023年；Murphy等，2016年；Smith等，2001年）。因此，SCC不仅是乳腺炎风险筛查的定量指标，也是原奶质量评估和乳制品供应链风险控制的关键分析参数。
在原奶监管、采购和质量分级系统中，SCC也被国际广泛用作评估牛奶来源质量的指标。欧盟法规（EC）第853/2004号规定了原奶的特定卫生标准，要求体细胞计数不得超过400,000个细胞/毫升，这一标准是在三个月内的滚动几何平均值，每月至少检测一次样本（欧洲议会和理事会，2004年）。在美国，“A”级巴氏杀菌牛奶条例也将SCC纳入原奶质量和监管评估中，规定单个生产者的牛奶中SCC不应超过750,000个细胞/毫升（美国农业部，2019年）。此外，《牛奶和乳制品卫生操作规范》强调在整个乳制品生产链中实施卫生控制，以确保产品安全和适合性（欧盟委员会，2004年）。因此，对于乳制品企业而言，SCC是一个重要的参数，用于评估牛奶来源质量、控制采购风险并确保加工适用性；对于奶牛场来说，在原奶交付前获得可靠的SCC结果有助于牛奶分类、重新检测、治疗决策和主动的质量风险预测。
目前，流式细胞术和显微镜计数仍然是可靠的SCC检测方法（标准化组织，2006年，2008b年）。流式细胞术具有高自动化程度、高通量和良好的重复性，被广泛应用于乳制品企业和检测中心的原奶SCC分析，但其高昂的成本和操作要求限制了其在农场现场的常规应用（Sun等，2023年；Widmer等，2022年）。显微镜计数也能提供准确的SCC结果，但样品制备、染色、载玻片制备以及手动细胞识别和计数耗时且依赖于操作者（Baro等，2005年）。相比之下，奶牛场通常难以获得大规模仪器（如流式细胞仪），也负担不起相关的维护成本和操作要求。这种高可靠性企业级检测与农场现场预筛查能力之间的不匹配使得农场在原奶交付前难以获得可比的SCC结果，可能导致加工方拒绝接收、价格处罚、牛奶废弃以及只有在交付后才发现不符合标准的情况时延迟采取乳腺炎干预措施。这一差距凸显了迫切需要一种低成本、便携、快速且操作简单的预筛查方法，能够在生产现场直接提供可靠的定量SCC评估。
以往的研究表明，基于视觉的成像仪器和便携式微流控荧光平台可以实现快速SCC检测，但这些系统主要证明了便携式或基于图像的SCC检测的可行性，并未完全解决农场现场常规预筛查在操作、标准化和可靠性方面的要求（Gao等，2020年；Kim等，2017年）。为了在农场实际应用，SCC检测仍需要在简化样品处理、图像采集标准化、检测区域代表性以及复杂原奶样本中的计数稳定性方面进行改进。针对这些实际需求，本研究开发了一种用于农场现场预筛查的样本处理型便携式芯片SCC检测系统。该系统并非旨在替代中心化的流式细胞术检测，而是一种低成本的前端筛查工具，能够在原奶交付前提供可操作的SCC信息。预装试剂的微流控芯片集成了解决原奶样本引入、片上荧光染色和构建稳定检测区域的功能，从而减少了离芯片预处理和检测过程中对额外试剂的需求。固定的荧光光学路径和基于USB相机的成像模块减少了外部设备和采集条件引起的成像变化，而由电机/轴承引导的扫描模块实现了每个样本的100个区域的自动荧光图像采集，提高了检测区域的代表性。结合自动图像识别和基于区域的计数策略，该系统实现了SCC输出的自动化，同时减少了人工操作并提高了测量重复性和可靠性。进一步通过对芯片特性、染色优化、成像性能评估、多区域采集稳定性分析以及实际样本验证，系统全面评估了该平台在农场现场SCC预筛查、乳腺炎风险识别和分娩前原奶质量控制方面的可行性。因此，核心挑战不仅在于使SCC计数方法便携化，还在于使定量SCC信息足够标准化、可重复、低成本，并能在交付前及时提供，以便农场做出决策。通过将互补组件整合到单一的便携式工作流程中，该系统超越了概念验证阶段的便携式SCC检测，朝着更完善的用于实际农场预筛查的平台发展。这种集成设计在保持与中心化参考检测结果的定量一致性的同时，降低了操作复杂性，从而解决了农场现场常规SCC测量的关键实际难题。
章节片段
材料和样品制备
使用商用牛奶体细胞分析仪Bentley FTS/FCM（Bentley Instruments，美国）作为参考方法，该分析仪基于标准化的荧光-光电-电子SCC计数原理，用于测量原奶样本的SCC（标准化组织，2006年）。使用Olympus IX51倒置荧光显微镜（Olympus，日本）评估便携式系统的成像性能。丙碘化物（PI）荧光染料和Triton X-100从北京Solarbio购买。
样品处理型便携式芯片SCC检测系统
为了在农场管理层做出决策时尽可能接近地获取SCC结果，开发了一种样品处理型便携式芯片SCC检测系统（图1A–C）。该系统无需依赖单独的离芯片染色、外部显微镜成像和手动计数，而是集成了解决试剂预装载芯片处理、固定荧光成像和自动化功能。
结论
本研究开发了一种低成本的样品处理型便携式芯片SCC检测系统，用于原奶交付前的农场现场预筛查。这项工作的意义不仅在于实现了快速的现场SCC检测，还在于将长期以来依赖企业级中心化检测的原奶质量评估方式，更接近于农场管理决策的决策点。对于乳制品供应链而言，这种检测位置的转变可能有助于...
CRediT作者贡献声明
孙晓云：撰写——初稿、验证、方法学、调查、数据分析。 鲍星义：方法学、调查、数据分析。 张俊婷：方法学、调查、数据分析。 蔡庆国：方法学、调查、数据分析。 刘雅玲：方法学、调查、数据分析。 陈爱良：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
本项工作得到了农业科技创新计划（CAAS-ASTIP-IQSTAP-03）的支持。
孙晓云 | 鲍星义 | 张俊婷 | 蔡庆国 | 刘雅玲 | 陈爱良
