工程改造纳氏盐单胞菌用于生物农药生产：从代谢途径优化到植物保护

《Bioresource Technology》：Engineering Vibrio natriegens for biopesticide production: from pathway optimization to plant protection

　　

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  工程化改造快速生长海洋细菌用于生物农药生产。
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  基于 I-SceI 的基因组编辑平台实现了稳定的多拷贝整合。
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  工程菌株无需抗生素筛选即可实现高 PCA 滴度。
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  Vna6 对细菌和真菌植物病原菌表现出广谱活性。
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  纳特维brio菌（V. natriegens）作为可持续底盘用于经济高效的作物病害管理。

引言

植物病原菌长期以来对植物健康构成严重威胁，导致主要作物损失并减少生物多样性（Ikram 等，2025，Omran 和 Baek，2022）。为了解决这个问题，自 20 世纪 50 年代以来，合成农药在保护农业生产率方面发挥了关键作用（Jin 等，2020）。然而，过度使用和不当管理导致土壤中有毒残留物积累，造成长期环境损害（Xu 等，2021）。随着健康和生态担忧的加剧，生物农药作为控制植物疾病的更可持续选择而受到关注（Ayilara 等，2023）。其中，微生物代谢产物——如制霉素（blasticidin-S）、春日霉素（kasugamycin）、多氧霉素（polyoxins）、谷瘟灵（validamycin）、阿维菌素（avermectins）和斯品诺莎德（spinosad）——是链霉菌属（Streptomyces）产生的重要例子（Gao 等，2017，Kasuga 等，2017，Li 等，2019，Tao 等，2019）。这些化合物现广泛用于农业系统中管理细菌和真菌病原菌以及昆虫害虫。

吩嗪类化合物（Phenazine compounds）代表了一类重要的生物农药，由于具有广谱抗真菌活性，在生物防治领域获得了相当多的关注（Krishnaiah 等，2018）。除了抗真菌特性外，这些化合物还表现出多种生物活性功能，包括抗肿瘤、抗癌和抗寄生虫作用，所有这些进一步激发了研究兴趣（Pierson & Pierson，2010）。其中，1-咔嗪甲酸（PCA）是最具代表性的成员，已被中国农业农村部注册为名为“神青霉素”（Shenqinmycin）的新型生物杀菌剂（Huang 等，2024）。在 1% 的浓度下，PCA 对多种作物病害表现出显著疗效，包括水稻纹枯病、辣椒疫病和黄瓜猝倒病（Jin 等，2015）。因此，PCA 的生物合成途径引起了广泛的研究关注。已证实，PCA 可由多种微生物属合成，包括假单胞菌属（Pseudomonas）、链霉菌属（Streptomyces）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、短杆菌属（Brevibacterium）和古菌属甲烷短杆菌（Methanosarcina）（Li 等，2025a）。然而，这些菌株的实际应用往往受限于较长的培养期或对碳源要求苛刻，从而限制了 PCA 的大规模生产和商业化（Li 等，2023）。因此，开发一种结合快速生长、广碳源利用和高底物转化效率的新型底盘微生物，对于 PCA 的商业化生物合成具有重要意义。

海洋细菌纳特维brio菌（Vibrio natriegens）已成为下一代生物合成中极具前景的底盘菌株，凭借其卓越的生长速率和高比底物摄取率，已被广泛应用于合成生物学研究（Lima 等，2024，Tschirhart 和 Vora，2026）。该生物在各种复杂培养基中表现出最短 7 至 10 分钟的生长倍增时间，在丰富培养基中的生长速率超过大肠杆菌（Escherichia coli）2 倍以上，在最小培养基中则快 2 至 4 倍（Lee 等，2019）。值得注意的是，V. natriegens 在好氧（约 3.90 ± 0.08 g/g/h）和厌氧（约 7.81 ± 0.08 g/g/h）条件下均表现出极高的葡萄糖摄取速率，凸显了其在工业微生物发酵方面的巨大潜力（Weinstock 等，2016）。此外，这种细菌能够以相当大的速率利用广泛的工业相关碳源，包括各种糖、醇类和有机酸（Lee 等，2024，Stella 等，2021，Sun 等，2024，Zhang 等，2021）。尽管具有这些优势，V. natriegens 迄今为止主要被开发为分子生物学和蛋白表达的宿主（Stukenberg 等，2021，Su 等，2025）。在各种候选底盘中，V. natriegens 因其快速生长、广泛的底物利用谱、高耐盐性以及日益可用的遗传工具而脱颖而出。这些特性共同解决了生物农药生产中的关键瓶颈，如发酵时间长、底物成本高和污染风险，使其成为 PCA 生物合成的有前景宿主。然而，目前尚无研究报告称在 V. natriegens 中合成 PCA。这一空白表明，其在农业生物技术中的潜力在很大程度上尚未被探索，特别是在代谢工程背景下生产高价值生物农药方面。

在本研究中，我们系统性地重构和优化了 V. natriegens 中的 PCA 生物合成途径，并全面评估了其在植物病害生物防治中的应用潜力。通过构建和优化包含各种启动子、核糖体结合位点（RBSs）和复制子的质粒工具箱，我们显著提高了 PCA 产量。然而，基于质粒的系统存在固有局限性，包括遗传不稳定性和对抗生素筛选的依赖性。为了克服这些问题，我们开发了一个基于归巢内切酶 I-SceI 的基因组工程平台。该酶识别 18 bp 序列并以高特异性引入双链断裂。利用该平台，我们实现了 PCA 生物合成模块向染色体的稳定多拷贝整合。所得工程菌株在不添加抗生素或不影响生长的情况下实现了高效的 PCA 生产，并且在 5 升生物反应器中的葡萄糖补料分批发酵下其性能进一步增强。该工程菌株在体外和体内进行的拮抗试验中对代表性植物病原细菌和真菌表现出显著的抑制活性，突显了其广谱生物防治潜力。总体而言，本研究为利用 V. natriegens 作为生产高价值生物农药的新型底盘奠定了基础，并为代谢工程和可持续农业病害管理提供了新的见解。

章节摘要

细菌菌株和培养条件

本研究中使用的所有细菌菌株、质粒和引物列于补充材料中。细菌培养及抗生素和诱导剂的使用细节见补充材料。

质粒和菌株构建

质粒和菌株构建的详细信息见补充材料。

荧光测量

基于细菌群体水平的荧光强度评估了 rfp 表达。过夜孵育后，培养物被稀释至新鲜

在 V. natriegens 中重编程 PCA 生物合成途径

PCA 是预防和控制多种作物病害的重要生物农药，包括水稻纹枯病、辣椒疫病、霜霉病、叶斑病、小麦镰刀菌穗腐病和溃疡病（Jin 等，2020）。已证实，PCA 可由多种微生物属合成，包括假单胞菌属、链霉菌属、伯克霍尔德氏菌属、短杆菌属和古菌属甲烷短杆菌，其相应的生物合成基因簇表现出显著

结论

本研究成功将 V. natriegens 工程化为 PCA 生产和生物防治应用的潜在平台。通过结合遗传元素的系统优化、开发基于 I-SceI 的基因组编辑工具以及多拷贝染色体整合，该工作克服了基于质粒系统的局限性（不稳定性、抗生素依赖性和生长负担）。所得菌株 Vna6 实现了高 PCA 滴度，在补料分批发酵中有效利用葡萄糖，

CRediT 作者贡献声明

Xinlu Cai: 撰写 – 原稿，可视化，正式分析，构思。Qingyue Cheng: 可视化，正式分析，构思。Youquan Zou: 可视化，正式分析。Anni Wang: 正式分析。Yujie Li: 正式分析。Ranyang Qiu: 正式分析。Wenjun Zhou: 正式分析。Endong Yang: 资金获取。Ting Xue: 撰写 – 审阅与编辑，资金获取。Jing Liu: 撰写 – 审阅与编辑，资金获取，构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文 reported 的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（32370076；32270194）、安徽省高校中青年杰出人才培养计划（YQZD2023017）；安徽省高校科研项目（2024AH050477；2022AH050914），中国农科院食品营养与健康联合研究中心研究基金（24242038）以及茶生物学国家开放基金的支持

Xinlu Cai|Qingyue Cheng|Youquan Zou|Anni Wang|Yujie Li|Ranyang Qiu|Wenjun Zhou|Endong Yang|Ting Xue|Jing Liu