《Biotechnology Advances》：From base transitions to expanded editing tools: development and applications of plant base editors
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摘要植物碱基编辑技术能够实现对目标核苷酸的定点替换，为功能基因组研究和作物改良提供了强有力的工具。相关工具箱已从经典的胞嘧啶编辑器和腺嘌呤编辑器，扩展到双碱基编辑、颠换编辑、基于Cas12的编辑系统以及靶向细胞器的编辑系统，大大拓宽了可及突变类型和基因组靶点的范围。这些进展为
摘要
植物碱基编辑技术能够实现对目标核苷酸的定点替换，为功能基因组研究和作物改良提供了强有力的工具。相关工具箱已从经典的胞嘧啶编辑器和腺嘌呤编辑器，扩展到双碱基编辑、颠换编辑、基于Cas12的编辑系统以及靶向细胞器的编辑系统，大大拓宽了可及突变类型和基因组靶点的范围。这些进展为产生有用等位基因、调控基因功能和实现定向进化提供了新的机遇。然而，碱基编辑能力的扩展并不必然意味着结果的可预测性或育种应用的可行性。本文综述了植物碱基编辑器的发展、靶点设计的计算工具及其在作物研究中的应用。我们考察了编辑器的架构，并比较了编辑效率、产物纯度和特异性，特别关注了颠换编辑。我们还着重阐述了碱基编辑器固有的技术局限性，以及从实验室研究迈向田间应用过程中遇到的瓶颈问题。通过将碱基编辑器的研发与实际约束条件相结合，本文旨在为编辑器选择提供指导，并识别将碱基编辑应用于作物改良的优先事项。
引言
成簇规律间隔短回文重复序列及CRISPR相关蛋白（CRISPR/Cas）系统因其简单性、可编程性和广泛的适用性，已成为植物基因组编辑的核心技术。CRISPR/Cas系统依赖于向导RNA（gRNA）引导Cas核酸内切酶到特定的基因组靶位点并引入双链断裂（DSB）。随后，内源修复通路——主要是非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）——可介导基因失活、插入或替换（Cong et al., 2013; Li et al., 2013）。尽管DSB介导的基因组编辑在产生功能缺失等位基因方面效果显著，但其固有局限性在于插入和缺失（indels）的不可预测性，以及在植物中HDR效率低下。这些约束给核苷酸水平的精确操作带来了重大挑战，尤其是在需要微妙序列变化来调控基因功能或蛋白活性时。
碱基编辑通过在不诱导DSB且无需供体模板的情况下实现精确的单核苷酸替换，解决了基于DSB的CRISPR/Cas编辑的局限性（Komor et al., 2016; Gaudelli et al., 2017）。通过将催化功能受损或失活的Cas蛋白（如Cas9切口酶或死Cas12）与脱氨酶或糖苷酶融合，碱基编辑器可催化定点化学转换，随后由内源DNA修复通路完成修复（Zhang et al., 2026a）。该策略显著减少了indels的形成并提高了编辑精度，使碱基编辑在需要可预测且可遗传的位点突变的应用中尤为具有吸引力。
胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）分别通过将Cas9切口酶与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶融合而开发，分别实现了C-to-T和A-to-G的碱基替换（Komor et al., 2016; Gaudelli et al., 2017）。在哺乳动物细胞中成功开发之后，CBE和ABE系统被迅速应用于植物基因组，并经历了广泛的优化。这些工作聚焦于提高编辑效率、缩小编辑窗口、扩展PAM兼容性以及降低脱靶活性（Mishra et al., 2020; Ren et al., 2018; Tan et al., 2022）。因此，碱基编辑工具已成为植物中最广泛使用的精确基因组编辑平台之一。
近期，碱基编辑的范围已扩展至经典的转换突变之外。基于糖苷酶的碱基编辑器（Zhao et al., 2021）、无脱氨酶系统（Tong et al., 2024a）以及工程化多功能编辑器的开发，实现了定点碱基颠换以及在同一靶位点内的双碱基编辑（Ma et al., 2024; Neugebauer et al., 2023）。与此同时，替代性CRISPR效应蛋白——尤其是Cas12家族的成员——也被探索用于拓宽靶标范围并缩小编辑器体积（Cheng et al., 2023）。除核基因组编辑外，在细胞器基因组工程方面也取得了重大突破（Arimura and Nakazato, 2024）。这些进展共同大幅拓展了植物精确而多样化的基因组操作分子工具箱。
碱基编辑技术的快速多样化催生了一系列广泛应用，包括功能基因探查、内源基因的饱和突变和定向进化、顺式调控元件的精细调控、选择性剪切的调节以及通过上游开放阅读框（uORF）实现的翻译控制（Hillary and Ceasar, 2024; Tuncel et al., 2025; Zhang et al., 2026a; Zhou et al., 2023）。这些应用凸显了碱基编辑产生等位基因系列和数量性状表型变异的独特能力，为基础植物生物学和作物改良提供了新的机遇。然而，要充分实现植物碱基编辑的潜力，需要克服当前编辑系统的固有限制以及从实验室研究迈向田间应用过程中的下游技术和监管瓶颈。
在本综述中，我们在此前关于植物碱基编辑技术及其应用的综述基础上，特别强调将碱基编辑器的分子设计与编辑效果及实际育种应用相联系。我们首先考察转换和颠换碱基编辑器、基于Cas12的系统以及靶向细胞器的编辑器的发展和优化，特别关注催化模块、编辑器架构和DNA修复通路如何影响编辑效率、产物纯度、精确性和特异性。我们还讨论了靶点设计的计算工具，并考虑了植物碱基编辑在多个基因调控层次上的应用。重要的是，我们区分了编辑器固有的局限性与农业应用中的下游障碍，包括育种相关等位基因的鉴定、优异种质的编辑、遗传稳定且不含转基因材料的创制、田间验证、分子可追溯性以及监管要求。通过整合这些方面，我们旨在为植物碱基编辑从分子工程迈向实际作物改良提供机制导向和部署导向的框架。
章节摘要
植物中的碱基转换与碱基颠换
近年来，碱基编辑技术的持续进步大大拓宽了植物中核苷酸替换的光谱和靶向平台的范围。早期发展主要聚焦于转换编辑系统，以胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器为代表，随后出现了具有更大编辑灵活性的双转换编辑器和基于TadA的编辑器。最近，颠换编辑器的出现进一步扩展了可及的突变类型。
植物碱基编辑靶点设计的计算工具
有效的碱基编辑器（BE）靶点设计受多种复杂参数的制约，包括PAM兼容性、定义的编辑窗口、特定的氨基酸替换、脱靶倾向以及预测的编辑效率（图4）。因此，手动靶点设计费时费力且易出错，尤其是在大规模文库构建中，这使得计算机辅助设计工具不可或缺。在实践中，典型的计算工作流程始于靶点选择。
植物碱基编辑的应用
精确的基因组编辑工具，尤其是碱基编辑技术，在植物中持续快速进步。编辑工具箱已从经典的ABE和CBE扩展到更广泛的编辑器阵列，包括DBE、CGBE、AYBE/AKBE和TBE等。随着这一进展，植物科学领域的研究工作也不断从技术开发转向多样化应用。目前，植物碱基编辑器已越来越多地应用于以下几个关键领域，包括基因功能研究。
植物碱基编辑的技术挑战
植物碱基编辑已从经典的转换编辑器快速发展到颠换和多功能编辑系统。然而，可及核苷酸转换范围的扩展并不必然保证编辑结果的效率、精确性和可预测性。因此，植物碱基编辑器的进一步改进不仅需要更广泛的编辑能力，还需要对编辑效率、产物纯度、精确性和特异性进行更强的控制。本节聚焦于分子层面的技术挑战。
从实验室到田间：植物碱基编辑的应用瓶颈
植物碱基编辑器的快速发展显著拓展了核苷酸替换的类型。然而，在分子水平上成功创制碱基编辑植物并不意味着该编辑植物可直接用于育种或商业化应用。将核苷酸水平的编辑应用于作物改良还需要若干额外步骤，包括鉴定和优先筛选育种相关等位基因、在优良种质中高效编辑等。
结论与展望
在过去十年中，植物碱基编辑已从经典的C-to-T和A-to-G转换编辑快速演变为一个多样化的工具箱，包括双碱基编辑器、颠换编辑器、替代性Cas核酸酶以及靶向细胞器的编辑系统。这些进展大幅拓展了可及核苷酸替换和基因组区域的范围，使编码序列、调控元件、剪接位点、uORF和细胞器基因的操作日益精确。同时……
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本研究得到广东省重点领域研发计划（2025B0202050004）、国家自然科学基金（32272120）、广西自然科学基金青年科学基金项目（2024GXNSFBA010386）、未来作物精准育种广东省基础研究中心项目（FCBRCE-202612）以及广东省种业振兴项目（编号：2024-NPY-00-044）的资助。
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