母体吡罗美拉汀治疗与产前持续光照暴露成年子代行为改变及海马pCREB/BDNF信号性别特异性变化的关联

《Behavioural Brain Research》：Maternal piromelatine treatment is associated with attenuated behavioral alterations and sex-specific changes in hippocampal pCREB/BDNF signaling in adult offspring following prenatal constant-light exposure

　　

摘要 孕期大脑发育易受环境因素影响。由于普遍存在的人造光暴露导致的慢性昼夜节律紊乱，已对身心健康产生不良影响。能够改变宫内环境的一个显著却常被忽视的环境因素是母体昼夜节律的紊乱。光作为昼夜节钟的主要同步信号（Zeitgeber, ZT），暴露于持续或不规则光照条件下（包括妊娠期间），可导致昼夜节律同步性破坏。产前暴露于改变的光/暗周期会深刻影响神经发育，导致子代持久的行为缺陷和情绪反应失调。这种方案还可能抑制母体褪黑素分泌，从而激活慢性生理应激通路。褪黑素是一种由松果体合成的激素，在调节昼夜节律和维持内分泌稳态（包括产前环境）中发挥核心作用。在啮齿动物和人类中，褪黑素均可轻易穿过胎盘。它通过调节下丘脑-垂体-肾上腺轴活动和促进神经可塑性来影响胎儿发育。母体褪黑素通常将光周期信息传递给胎儿，对组织子代昼夜节律和使胎儿为宫外生活做好准备至关重要。其剥夺与神经系统发育异常和海马依赖性学习缺陷有关。早期发育干扰与脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）的显著变化密切相关，BDNF是突触可塑性和长时程增强的关键调节因子。磷酸化形式的cAMP反应元件结合蛋白（phosphorylated cAMP-responsive element binding protein, pCREB）作为BDNF基因的直接转录激活因子，在长时记忆巩固中发挥核心作用。此外，有证据表明昼夜节律和光周期节律的破坏会减弱BDNF的表达。吡罗美拉汀（Piromelatine, Neu-P11; pir）是一种褪黑素MT1/MT2受体激动剂，同时具有血清素能受体活性，包括5-HT1A/5-HT1D激动作用和5-HT2B拮抗作用。已有报道称其在多种动物模型中发挥抗抑郁样、神经保护、记忆增强和代谢效应。研究人员近期的研究表明，在慢性产前应激模型中，母体产前使用这种褪黑素类似物处理，对成年子代的睡眠结构、行为和认知损伤产生性别依赖性的有益影响。这些发现促使研究人员进一步探究母体pir处理是否能同样影响妊娠期持续光照暴露对子代的长期后果，包括成年子代自主活动昼夜节律组织的改变。本研究检测了妊娠期母体给予pir处理对成年雄性和雌性子代的行为及海马分子效应。由于子代在出生后未再接触pir，因此在成年期观察到的行为和分子差异被解释为与母体产前处理相关的持续性结果，而非pir对子代的急性效应。该研究进一步评估了海马pCREB/BDNF信号的变化是否与所观察到的行为效应相关，以及这些反应在雄性和雌性子代间是否存在差异。

论文解读文章

1. 研究背景与目的

孕期大脑发育对外部环境因素高度敏感。现代社会中普遍存在的人造光暴露导致的慢性昼夜节律紊乱，已被证实对身心健康有不利影响。其中，母体昼夜节律的破坏是一个重要但常被忽视的因素，它能改变子宫内环境。光作为昼夜节律的主要同步信号（Zeitgeber, ZT），当孕期暴露于持续或不规则光照条件时，会导致昼夜节律同步性受损。产前持续光照暴露（constant light exposure, CLE）会深刻影响子代的神经发育，造成持久的行为缺陷和情绪反应失调，并可能通过抑制母体褪黑素分泌来激活慢性生理应激通路。褪黑素作为一种关键的昼夜节律调节激素，能通过胎盘影响胎儿发育，其缺失与神经系统发育异常和海马依赖性学习缺陷相关。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）及其上游转录调控因子——磷酸化的cAMP反应元件结合蛋白（phosphorylated cAMP-responsive element binding protein, pCREB）是调节突触可塑性和记忆巩固的核心分子，而昼夜节律紊乱会抑制其表达。

吡罗美拉汀（Piromelatine, pir）是一种兼具褪黑素MT1/MT2受体激动活性和血清素能受体（如5-HT1A/5-HT1D激动、5-HT2B拮抗）活性的化合物，已在多种动物模型中显示出抗抑郁、神经保护和促认知等效果。研究人员的前期工作表明，在慢性产前应激模型中，母体给予pir处理对成年子代的睡眠、行为和认知功能有性别依赖性的改善作用。基于此，本研究旨在探究：在妊娠期CLE模型中，母体pir处理是否能减轻子代长期的行为和分子异常，特别是对成年子代自主活动昼夜节律的影响；以及这些效应是否与海马pCREB/BDNF信号通路的改变有关，并考察其中的性别差异。

2. 主要关键技术方法

研究人员使用了Wistar大鼠作为实验动物。首先建立了产前CLE模型，将孕鼠随机分为正常光/暗循环组（LD）和持续光照组（LL）。在LL组内，又分为溶剂对照组（LL-veh）、阳性对照药物褪黑素处理组（LL-mel）和pir处理组（LL-pir），另设正常光照溶剂对照组（LD-veh）。药物从妊娠第0天至第21天每天皮下注射给药。子代在出生后第21天断奶，并在成年期（约第60天）进行一系列行为学测试，包括：用于评估快感缺乏（抑郁样行为核心特征）的蔗糖偏好测试（sucrose preference test, SPT）；用于评估自我护理和动机行为的泼洒测试（splash test）；用于评估焦虑样行为的旷场实验（open field test, OFT）和高架十字迷宫实验（elevated plus maze test, EPM）；用于评估空间工作记忆的Y迷宫自发交替行为（spontaneous alternation behavior, SAB）测试和八臂放射状迷宫（radial arm maze, RAM）测试；以及用于监测24小时自主活动昼夜节律的活动度记录仪（actimeter）测试。在行为测试结束后，研究人员在光照期特定时间点（ZT6）处死动物，取海马组织，采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）法检测BDNF和pCREB的蛋白水平。每个实验组包含来自4-5窝的8只大鼠，每窝同一性别不超过2只。

3. 主要研究结果

3.1. 剂量探索实验

在预实验中，研究人员通过SPT和Y迷宫测试比较了10 mg/kg和20 mg/kg两个pir剂量的效果。结果显示，两种剂量均能有效逆转产前CLE引起的雄性和雌性子代快感缺乏和工作记忆损伤，且效果无显著差异。因此，后续主实验选用10 mg/kg剂量以减少孕期药物暴露。

3.2. 产前吡罗美拉汀处理与成年子代抑郁和焦虑相关指标的差异

通过SPT和泼洒测试评估抑郁样行为。结果表明，产前CLE诱导了雄性和雌性子代的快感缺乏和自我护理行为减少（即抑郁样行为）。母体pir处理能有效逆转这两种抑郁样指标，且在SPT中效果优于阳性对照药褪黑素。通过OFT和EPM测试评估焦虑样行为。结果显示，产前CLE减少了子代在OFT中央区和EPM开放臂的探索时间，表明焦虑水平升高。母体pir处理能显著增加子代在这些区域的探索时间，缓解焦虑样行为，效果与褪黑素相当。此外，在OFT中，产前CLE仅降低了雄性而非雌性子代的总活动距离，而pir和褪黑素均能恢复雄性这一运动缺陷。

3.3. 母体吡罗美拉汀处理与产前CLE模型子代工作记忆表现的关联

通过Y迷宫SAB测试和RAM测试评估空间工作记忆。Y迷宫测试显示，产前CLE显著降低了雄性和雌性子代的SAB百分比，表明工作记忆受损。母体pir处理能显著提高SAB，且在雌性子代中效果优于褪黑素。RAM测试进一步证实了这一发现。产前CLE增加了雄性和雌性子代的工作记忆错误数（working errors, WE）、双重工作记忆错误数（double working errors, DWE）和任务完成时间。母体pir处理能显著减少这些错误并缩短完成时间，全面改善了工作记忆表现，效果与褪黑素类似或更优。

3.4. 母体吡罗美拉汀处理与子代海马pCREB和BDNF水平的性别特异性关联

ELISA检测结果显示，产前CLE显著降低了雄性LL-veh子代海马中的BDNF和pCREB水平。母体pir和褪黑素处理均能显著提高雄性LL-pir和LL-mel子代的海马BDNF和pCREB水平。然而，在所有雌性实验组中，海马BDNF和pCREB水平均未观察到统计学显著差异。这表明，母体pir处理对海马pCREB/BDNF信号的影响具有性别特异性，仅在雄性后代中观察到上调效应。

4. 讨论与结论

讨论部分总结：

本研究发现，在产前CLE模型中，母体pir处理与成年雄性和雌性子代多种行为异常的改善相关联，包括抑郁样、焦虑样行为和工作记忆缺陷，其效果与阳性对照药褪黑素相当。这提示母体褪黑素能信号在孕期对子代神经行为发育具有潜在重要性。然而，研究人员强调，由于药物是给予孕鼠而非子代，这些结果应被理解为母体处理相关的关联性差异，而非证明pir具有直接的抗抑郁、抗焦虑或认知增强作用。研究还指出，行为测试是在固定的ZT时间进行的，而未考虑个体动物的内在相位差异，这可能影响了基于探索活动的行为结果。对24小时自主活动的个体水平余弦分析显示，各组内动物节律性存在显著异质性，且未发现治疗组对MESOR或振幅有显著影响，因此不能证明母体pir处理恢复了子代的昼夜节律。关于分子机制，虽然雄性LL-pir子代的海马pCREB和BDNF水平升高，但雌性子代并未观察到类似变化，而行为改善在两性中都存在。这种性别特异性的分子-行为分离现象表明，pCREB/BDNF信号上调并非解释所有行为效应的唯一机制，可能涉及其他如血清素能系统或昼夜节律调节等通路。研究的局限性包括：样本量较小（尤其是活动度监测）、未进行相位匹配的行为测试、缺乏母体昼夜节律的直接测量、分子检测仅为单时间点数据，以及未控制雌性发情周期。因此，当前发现不能归因于单一的特定机制，也不能作为支持pir在孕期治疗用途的证据。

研究结论翻译：

在妊娠期CLE模型中，与相应的LL-veh组相比，母体pir处理与成年雄性和雌性子代焦虑和抑郁相关行为改变的减轻以及工作记忆表现的改善相关联。在雄性后代中，这些行为差异伴随着分子取样时间点海马pCREB和BDNF水平的升高，而在雌性后代中未检测到相应的分子差异。这种性别特异性的分离表明，行为发现不能统一归因于pCREB/BDNF信号通路。个体水平分析揭示了异质性的24小时自主活动节律性，且未发现治疗组对MESOR或振幅有显著影响。因此，活动度发现并不能证明母体pir处理恢复或正常化了昼夜节律。由于未评估母体昼夜节律相位、行为测试未进行相位匹配、且pCREB和BDNF仅在单一时间点测量，昼夜节律生物钟介导的解释仍是一个合理但悬而未决的假说。因此，这些发现展示了与母体pir处理相关的行为和性别特异性海马分子差异，但并未确立其具有独立于昼夜节律的抗抑郁、抗焦虑、认知增强或BDNF增强作用。需要进行包含母体昼夜节律测量、相位匹配的行为测试、纵向活动度监测、多个分子采样时间点、适当的窝别水平分析以及直接通路干预的进一步研究，以确定这些关联背后的机制。