肾小管理性Nrf2缺失通过减轻肾小球高压与肾损伤改善Akita糖尿病小鼠的糖尿病肾病

《Diabetologia》：Renal tubule-specific Nrf2 deletion ameliorates diabetic kidney disease by attenuating glomerular hypertension and kidney injury in a mouse model of diabetes

　　

研究人员既往报道核因子红系2相关因子2（NRF2）在人类糖尿病及糖尿病小鼠模型肾小管的表达上调，并假设肾小管特异性删除Nrf2可改善Akita小鼠（1型糖尿病模型）的肾高滤过与肾损伤。本研究将Pax8-Cre小鼠与Nrf2 floxed小鼠杂交，在C57BL/6背景下建立Akita Nrf2RT KO小鼠；设雄性非糖尿病Nrf2fl/fl、Nrf2RT KO、Akita Nrf2fl/fl与Akita Nrf2RT KO四组，观察至20周（每组n=8）。结果显示：Akita Nrf2fl/fl小鼠肾小球滤过率（GFR）、肾肥大、小管损伤评分、肾小球基底膜厚度、足细胞丢失、足突消失及尿白蛋白/肌酐比显著升高；Akita Nrf2RT KO小鼠上述改变明显减轻。与Akita Nrf2fl/fl相比，Akita Nrf2RT KO小鼠入球小动脉扩张与出球小动脉收缩减弱；肾近端小管钠-葡萄糖共转运蛋白2（SGLT2）与血管紧张素原（AGT）表达下调。对Akita Nrf2RT KO小鼠使用选择性A1腺苷受体抑制剂可提高GFR与葡萄糖排泄分数，提示增强的腺苷信号经管球反馈（TGF）参与肾血流动力学改变及肾小球损伤减轻。结论：小管NRF2通过调控GFR、近端小管SGLT2与AGT表达及TGF，在Akita小鼠糖尿病肾病进展中发挥重要作用。

研究背景方面，核因子红系2相关因子2（NRF2）是调控细胞内抗氧化防御、维持稳态的转录因子。NRF2激活剂巴多索隆甲酯（BARD）曾用于糖尿病肾病（DKD）等疾病的临床试验：BEACON试验在2型糖尿病合并晚期慢性肾病（CKD）患者中虽提高估算GFR（eGFR），却伴蛋白尿增加与心衰事件增多而被终止；CARDINAL试验在Alport综合征中初期维持eGFR，但停药后eGFR快速下降，长期获益不明确。早期DKD存在肾小球高滤过，表现为肾小球肥大、入球小动脉扩张和/或出球小动脉收缩，推动足细胞丢失与蛋白尿，但高滤过致肾小球损伤机制未明。肾近端小管（RPT）中SGLT2在糖尿病时表达上调，SGLT2抑制剂具心肾保护；肾内局部肾素-血管紧张素系统（RAS）中，近端小管细胞可表达血管紧张素原（AGT），高血糖经活性氧（ROS）促AGT转录，AGT与SGLT2表达正相关。已有研究提示全局Nrf2缺失可降低糖尿病小鼠GFR、蛋白尿及RPT中SGLT2、AGT表达，但肾小管特异性Nrf2在DKD中的作用尚不清楚，因此研究人员在Akita小鼠中开展肾小管理性Nrf2缺失研究。该论文发表于《Diabetologia》。

主要技术方法方面，研究人员以Jackson Laboratory获得的Akita、Nrf2 floxed及Pax8-Cre小鼠构建肾小管理性Nrf2敲除（Nrf2^RT KO）及Akita Nrf2^RT KO小鼠，样本为雄性非糖尿病与Akita糖尿病小鼠队列；采用尾套法测收缩压，空腹血糖检测，FITC-inulin法测GFR，代谢笼收集尿测算白蛋白/肌酐比与葡萄糖排泄分数；Percoll梯度分离RPT；免疫荧光、免疫组化、电镜评估结构，活体成像测入球/出球小动脉直径与单肾单位GFR；Western blot、RT-qPCR测NRF2、NQO1、AGT、SGLT2等；ELISA测血清/尿AGT与血管紧张素II（Ang II）；并以选择性A1腺苷受体抑制剂处理验证腺苷信号作用。

研究结果如下。Nrf2 expression in Akita Nrf2^fl/fl and Akita Nrf2^RT KO mouse kidneys：通过基因型、Western blot、免疫荧光/免疫组化及氧化应激染色，研究人员证实Akita Nrf2^fl/fl小鼠RPT中NRF2与下游NQO1高表达，Nrf2^RT KO后RPT NRF2几乎消失、NQO1下降，而DHE与8-OHdG所反映的氧化应激在缺失组增强，说明小管Nrf2缺失削弱抗氧化程序。

Physiological measurements in mice：通过体重、空腹血糖、收缩压、尿量、肾重/胫骨长、GFR与尿白蛋白测定，研究人员发现糖尿病使GFR、肾肥大、蛋白尿升高，而Akita Nrf2^RT KO小鼠这些指标较Akita Nrf2^fl/fl显著回落，但血糖与血压两组糖尿病鼠无差异，表明保护效应不依赖降糖或降压。

Histology：经PAS、天狼星红染色及Fn1、Col4a3 mRNA分析，研究人员显示Akita Nrf2^fl/fl有肾小球丛体积增大、RPT细胞面积增加、小管损伤与纤维化增强，Nrf2^RT KO使上述结构损伤与纤维化标志物下降。

Effect of RT deletion of Nrf2 on AGT and SGLT2 expression in Akita mice：借免疫染色、qPCR与Ang II/尿AGT检测，研究人员证明糖尿病RPT中AGT、SGLT2上调，小管Nrf2缺失下调Agt与Sglt2 mRNA及蛋白，尿Ang II与尿AGT降低，葡萄糖排泄分数进一步升高，而Sglt1、Glut2无变化。

Podocyte number：以p57/nephrin与WT1/synaptopodin双标，研究人员发现Akita Nrf2^fl/fl足细胞数减少，Akita Nrf2^RT KO保留更多足细胞，提示小管改变可远程减轻肾小球细胞丢失。

Electron microscopy and intravital microscopy：通过电镜与活体显微，研究人员观察到Akita Nrf2^fl/fl足突广泛消失、基底膜增厚，Akita Nrf2^RT KO减轻超微结构损伤；同时Akita Nrf2^fl/fl入球小动脉扩张、出球小动脉收缩，缺失后这种血流动力学偏移被衰减。

A1 adenosine receptor inhibition：用选择性A1腺苷受体抑制剂处理Akita Nrf2^RT KO与Akita Nrf2^fl/fl小鼠，研究人员发现抑制A1受体可提高GFR与葡萄糖排泄分数，支持小管Nrf2缺失后增强的腺苷信号经管球反馈参与血流动力学与损伤调节。

讨论部分总结：研究人员指出，全身Nrf2缺失与小管特异性Nrf2缺失均改善糖尿病小鼠高滤过与蛋白尿，说明NRF2在肾小管的内源性作用未必是抗氧化保护，反而通过促进SGLT2与AGT表达、增强局部RAS与腺苷相关管球反馈，驱动入球扩张、出球收缩、肾小球高压及足细胞损伤。该结果解释了NRF2激活剂在临床试验中改善滤过却加重蛋白尿/心衰的矛盾，并为DKD治疗提示：靶向肾小管NRF2通路可能比全身激活NRF2更安全。

结论部分翻译：这些发现提示，在Akita小鼠中，肾小管理性NRF2通过调控肾小球滤过率以及肾近端小管中钠-葡萄糖共转运蛋白2（SGLT2）与血管紧张素原（AGT）的表达和管球反馈，在糖尿病肾病进展中发挥重要作用。