多发性硬化中免疫细胞异质性揭示CD14+髓系细胞特异性功能障碍及CD4+、CD8+免疫细胞的不同调控程序

《Discover Immunity》：Immune cell heterogeneity in multiple sclerosis reveals myeloid-specific dysfunction and distinct regulatory programs across CD14+, CD4+, and CD8+?immune cells

　　

背景：多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）是一种由外周免疫反应失调驱动的神经炎症和神经退行性疾病。在免疫细胞中，髓系细胞（CD14⁺单核细胞）是启动和维持中枢神经系统（central nervous system, CNS）炎症的关键参与者，但其细胞特异性分子功能障碍仍未完全阐明。方法：研究人员对来自MS患者与健康对照的CD14⁺单核细胞以及CD8⁺和CD4⁺ T细胞的bulk RNA-seq（批量RNA测序）数据进行了整合系统生物学分析。分析流程包括差异表达、通路富集、蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络聚类、枢纽基因（hub gene）识别和上游调控因子分析（转录因子、激酶、长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs））。使用独立数据集进行验证。结果：髓系细胞（CD14⁺）表现出独特的促炎和代谢应激特征，包括RNA150、CTLA4、KIF5A、THBS1、EGR2、KCNA2、OCLN、FLT4上调，以及IL13、FGF8下调。功能富集显示NF-κB、趋化因子和Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）信号过度活跃，同时抗炎和脂蛋白代谢通路受到抑制。髓系PPI网络中三个显著子网络（clusters）揭示了与CACNA1H、LEF1和SOST相关的Wnt和钙信号失调。上游调控分析识别出EGR3、FOXJ1、ID1、LEF1为控制髓系功能障碍的关键转录因子。在T细胞中观察到互补性改变，但最显著的转录和调控改变见于髓系区室。结论：研究人员的整合转录组和网络分析揭示了多发性硬化中CD14⁺单核细胞、CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞之间存在显著免疫细胞异质性。在这些细胞群体中，CD14⁺单核细胞表现出最明显的转录、功能和调控改变，特征为失调的炎症、代谢、Wnt信号和钙信号程序。识别出的细胞类型特异性枢纽基因和调控因子突出了不同的免疫细胞状态，并提示以髓系为中心的功能障碍是MS免疫病理的主要组成部分。这些发现为理解多发性硬化中免疫细胞异质性和神经免疫相互作用提供了系统层面框架。

**论文解读**

**研究背景与问题**
多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）是一种慢性自身免疫性疾病，免疫系统攻击中枢神经系统（central nervous system, CNS）髓鞘，破坏神经元通讯并导致进行性神经功能缺损。尽管已有疾病修正治疗（disease-modifying therapies, DMTs），如干扰素-β、醋酸格拉替雷、Natalizumab、Fingolimod、Ocrelizumab等，但MS仍无法治愈。现有治疗存在仅减少而不消除疾病活动、长期免疫抑制增加感染风险、成本高、疗效差异大等局限。其他免疫抑制和抗炎药物常为非特异性免疫抑制，副作用明显，且多仅提供短暂症状缓解。单克隆抗体可耗竭特定淋巴细胞亚群，但存在输注反应、感染和继发自身免疫风险。造血干细胞移植（haematopoietic stem cell transplantation, HSCT）具有高发病率、死亡风险及长期疗效不一致等问题。神经保护和再髓鞘修复药物多处于早期试验，持久临床有效性尚未确立。MS治疗困难的根本原因在于对驱动疾病的分子机制理解不全，尤其是MS免疫细胞中的上游调控因子（转录因子、非编码RNA、表观遗传修饰）以及下游细胞因子产生和CNS免疫迁移改变尚未被全面绘制。bulk RNA-seq结合系统生物学可进行全局转录组分析和网络重建，以发现枢纽基因和调控通路。研究人员检查三种关键致病免疫亚群：CD14⁺单核细胞、CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞。鉴于髓系区室是CNS炎症早期先天驱动因素，研究人员假设CD14⁺细胞比两个T细胞亚群表现出更广泛且中心连接的转录失调，并在同一患者队列中进行头对头比较。

**研究人员开展的研究、结论及意义**
研究人员利用bulk RNA-seq数据，对MS患者与健康对照的CD14⁺单核细胞、CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞进行整合系统生物学分析，比较差异表达、功能富集、网络拓扑和上游调控结构。结果显示，CD14⁺单核细胞具有最显著的转录、功能和调控改变，涉及炎症、代谢、Wnt信号和钙信号程序失调。研究识别出细胞类型特异性枢纽基因和调控因子，提示以髓系为中心的功能障碍是MS免疫病理的主要组成部分，为理解免疫细胞异质性和神经免疫相互作用提供系统层面框架。

**主要关键技术方法**
研究人员使用GEO数据库GSE137143的bulk RNA-seq数据，来源为MS患者与健康对照的CD14⁺单核细胞、CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞，共427例样本，其中162例男性、265例女性，按Kicheol Kim等2021方法预处理。PCA去除噪声样本：CD4⁺ T细胞7例、CD8⁺ T细胞3例、CD14⁺单核细胞6例。DESeq2鉴定差异表达基因；Enrichr进行KEGG和生物过程（biological process, BP）富集；STRING构建PPI网络，CentiScaPe计算betweenness，elbow确定枢纽基因，MCODE识别子网络；八个调控数据库分析上游调控因子并与差异表达基因比较；GSE26927、CellMarker 2.0、MSigDB、GSE1910及macrophage-vs-monocyte RNA-seq数据进行外部评估。无实验验证。

**研究结果**

**3.1 差异表达基因分析**
研究人员重新分析427例样本，CD4⁺ T细胞为120例MS和21例健康对照，CD8⁺ T细胞为121例MS和21例健康对照，CD14⁺单核细胞为122例MS和22例健康对照。每个基因表达谱覆盖58,440个基因。CD14⁺单核细胞鉴定出428个差异表达基因（296个上调、132个下调），CD8⁺ T细胞267个（116个上调、151个下调），CD4⁺ T细胞346个（98个上调、248个下调）。火山图显示各免疫细胞类型的差异表达基因分布。

**3.2 功能富集分析**
CD14⁺细胞中17条KEGG上调通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用和NF-κB信号通路，BP上调功能66个，包括正调控细胞过程；下调基因无显著KEGG通路，BP功能9个，包括负调控脂蛋白颗粒清除、负调控低密度脂蛋白受体活性、单酰甘油生物合成和钠离子跨膜转运调节。CD8⁺ T细胞中15条KEGG上调通路包括移植物抗宿主病、同种移植排斥和病毒性心肌炎，BP上调功能61个包括氧运输；BP下调功能29个包括趋化因子产生调节、负调控CD4⁺αβ T细胞增殖和正调控TLR7信号。CD4⁺ T细胞中2条KEGG上调通路为非洲锥虫病和疟疾，与CD14⁺和CD8⁺共有；BP上调功能19个包括活性氧反应；KEGG下调通路3条包括抗原加工和提呈。三细胞共享6个BP上调功能：氧运输、二氧化碳运输、一碳化合物运输、气体运输、过氧化氢分解和正调控细胞死亡；CD4⁺和CD8⁺共享对过氧化氢反应和细胞死亡调节；CD14⁺和CD8⁺共享视网膜稳态和负调控B细胞激活；下调基因中仅CD4⁺和CD8⁺共享负调控神经元分化。

**3.3 蛋白-蛋白相互作用网络构建与分析**
CD14⁺巨噬细胞网络包括86个节点和166条边，CD8⁺ T细胞网络104个节点和40条边，CD4⁺ T细胞网络50个节点和110条边。基于betweenness drop-off标准，CD14⁺选15个枢纽基因，CD8⁺和CD4⁺各选10个。CD14⁺最高分枢纽基因为CTLA4，CD8⁺为ZBTB7C，CD4⁺为CD1C；WNT5A是CD4⁺和CD8⁺共享枢纽基因且两者均下调。MCODE仅在CD14⁺网络获得三个显著子网络：Cluster 1涉及NF-κB和趋化因子信号，BP包括凋亡调节和正调控细胞因子产生；Cluster 2涉及Wnt信号等23条KEGG通路，BP包括Wnt信号等146个功能；Cluster 3涉及钙信号等13条KEGG通路，BP包括钙离子跨膜导入胞质等33个功能。Cluster 2和3共享Cushing综合征通路，以及细胞对有机物质反应和细胞对激素刺激反应；Cluster 3和1共享5个BP功能，包括正调控大分子代谢、IL-4产生调节、多细胞生物过程正调控、宿主对共生体调节和细胞趋化。

**3.4 上游富集分析**
使用八个数据库分析上游调控因子。CD14⁺中LEF1和ID1出现在差异表达基因中，另有EGR3、FOXJ1、EGR2被识别；CD8⁺中ZBTB7C、ALPK2和SMIM2-AS1被识别；CD4⁺未发现额外调控蛋白。CD14⁺ Cluster 1调控因子包括EGR2、LEF1、LTF、TRBV11-2和LINC00200；Cluster 2包括LEF1和TRBV11-2；Cluster 3中ZNF483下调，与KCNA2和KCNMA1上调相关。LEF1和TRBV11-2为Cluster 1和2共享调控因子。LEF1既是转录因子又是枢纽基因，与FOXJ1、TRBV11-2、IL13和CTLA4互作；LTF与IL13、CCR8、CD40LG和CD83互作；EGR2与CCL4、CCL3L3、FGF9、FGF8、CD83、CCR8、LIF、DEFA3和EGR3互作；EGR3与CD83、IL24、ID1和EGR2互作；LINC00200与IL13互作，且LINC00200过表达而IL13下调提示潜在抑制关系。CD8⁺调控网络含44个节点和52个互作，ZBTB7C上调、ALPK2上调、SMIM2-AS1下调，SELENBP1位于网络中央起桥接作用。

**3.5 候选基因外部评估**
CellMarker 2.0显示CD14⁺高表达候选基因分布于不同组织，如THBS1见于肺组织、IL13见于其他组织、CLEC10A见于心脏组织、EGR2见于蜕膜区CD14⁺单核细胞、CD1C见于皮肤CD14⁺单核细胞。CD4⁺ T细胞枢纽基因在胃、外周血、胆管和肾组织的CD40LG巨噬细胞中升高。CTLA4也在CD8⁺和CD4⁺细胞中表达；CCL4在动脉组织巨噬细胞和CD4⁺ Th1细胞中表达；LEF1在血液、肝、脾和骨髓的CD4⁺ Th和CD8⁺ T细胞中报道。MSigDB数据显示EGR1、EGR3、CCL4和ID1在巨噬细胞相对于单核细胞中改变；EGR1在CD4⁺ T细胞MS条件下下调；EGR3和CCL4分别为CD14⁺枢纽基因和上调转录因子。GSE26927等数据集显示EGR1在CD4⁺ T细胞中log₂FC约0.5，SCN2A在CD8⁺ T细胞中下调且死后CNS组织log₂FC约0.8，AXIN2在CD14⁺枢纽基因中升高且死后CNS组织log₂FC约1.67。研究未进行实验验证。

**讨论部分总结**
讨论指出，RNF150在MS患者CD14⁺单核细胞中显著过表达（log₂FC约3），为首次将该基因与MS中CD14⁺单核细胞生物学关联；基于ELAVL1降解机制，研究者提出RNF150过表达可能促进促炎单核细胞表型的可检验假设。TBC1D3在CD4⁺和CD8⁺ T细胞中大幅上调约22倍，同时EGR1、EGR3和EGR4下调，提示T细胞耐受检查点破坏；CD14⁺中TBC1D3上调约6倍，但EGR2和EGR3上调，提示髓系区室可能存在保护或代偿作用。CD8⁺ T细胞中GVHD、同种移植排斥和病毒性心肌炎等通路上调，反映细胞毒性；趋化因子产生、TLR7信号和负调控CD4⁺ T细胞增殖下调。CD4⁺ T细胞中ROS反应、RIG-I信号、MDA-5信号和细胞死亡调节上调，抗原加工和提呈下调。三细胞共享氧和二氧化碳运输、一碳代谢、过氧化氢分解和正调控细胞死亡等过程，提示代谢活跃、氧化应激管理和细胞死亡调控。CD14⁺功能簇涉及Cushing综合征通路、CACNA1H、LEF1和SOST，提示钙和Wnt信号与炎症和修复平衡有关。枢纽基因方面，CTLA4在CD14⁺网络中具有高betweenness，提示髓系内在调节；LEF1与CACNA1H、SOST构成Wnt-钙轴；NEFL作为轴突损伤标志物出现在CD14⁺网络；其他CD14⁺枢纽基因包括KIF5A、THBS1、FGF8、IL13、EGR2、KCNA2、OCLN和FLT4。CD8⁺枢纽基因涉及ZBTB7C、PAX2、HOXB6、SLC4A1、SELENBP1、SCN2A、CYP26A1、ALPK2和PIGR；CD4⁺枢纽基因涉及EGR1、WNT5A、CLEC4C、CLEC10A、FCER1A、CD1C、CD1E、CD1B、HBB和FAT1。调控因子方面，CD14⁺涉及EGR2、LEF1、LTF、TRBV11-2、LINC00200和ZNF483；CD8⁺涉及ALPK2和ZBTB7C。整合网络提示Wnt信号、钙信号、代谢和抗氧化防御在免疫细胞状态中具有协同作用。研究局限在于主要差异表达和调控网络分析来自单一大型公开队列，虽用额外数据集检查候选基因，但枢纽基因优先级和推断调控网络未独立重建和实验验证，因此结果应视为探索性，需独立队列和功能研究验证。总体模型认为MS以先天和适应性免疫区室显著异质性为特征，CD14⁺单核细胞表现出最广泛的转录和调控重塑；不同细胞类型特异性通路、枢纽基因和上游调控因子提示不同免疫群体在疾病进展中占据独特功能状态，强调需超越单一细胞类型视角，考虑协调而异质的免疫景观。该细胞类型层级为未来机制研究提供框架，提示髓系导向策略可能针对相对未被充分靶向但转录占优势的MS病理区室。

**研究结论（原文结论部分翻译）**
总之，这项工作重新发现髓系细胞是MS免疫病理的中心驱动者。通过对CD14⁺单核细胞/巨噬细胞转录组应用多层系统生物学方法，研究人员揭示了既往未被充分认识的髓系特异性分子失调，包括：促炎基因RNF150和代谢应激通路（NF-κB、趋化因子、TLR、HIF-1相关特征）；抗炎和脂代谢程序受抑（IL13、FGF8、脂蛋白清除）；具有高网络中心性的新枢纽基因（CTLA4、THBS1、KCNA2、OCLN、FLT4、EGR2）；三个与Wnt信号（LEF1、SOST）、钙信号（CACNA1H）和Cushing综合征相关通路关联的功能簇；关键上游调控因子（EGR3、FOXJ1、ID1、LEF1），它们是CD14⁺单核细胞中MS相关炎症转录程序的候选调控因子。尽管这些发现具有假设生成性，但髓系特异性枢纽基因及失调的Wnt、钙和炎症程序的识别为优先开展未来机制研究提供了框架。这些分子改变是否具有功能或治疗相关性，需要在独立队列和实验模型中验证。重要的是，本研究展示了通过现代转录组和网络分析重新发现已知免疫细胞的能力。通过将髓系细胞置于中心，研究人员提供了一个分子框架，可指导未来MS及其他潜在神经炎症疾病的实验验证和精准免疫调节。