PDIA3 和 CANX 通过靶向 FGFR4 拮抗 EMCV 诱导的胞质钙升高以限制病毒复制

《Veterinary Microbiology》：PDIA3 and CANX Counteract EMCV-Induced Cytosolic Calcium Elevation by Targeting FGFR4 to Restrict Viral Replication

　　- EMCV感染导致胞质Ca2?升高，而胞内Ca2?升高有利于EMCV复制。- CANX和PDIA3的过表达对EMCV感染具有抑制作用。- CANX或PDIA3能抑制病毒感染以及由离子霉素介导的胞质Ca2?升高。- PDIA3和CANX通过调控FGFR4介导的钙释放来抑制EMCV复制。## 引言内质网（ER）是蛋白质折叠、钙离子储存和脂质合成的核心枢纽，在应激反应（包括病毒感染）决定细胞命运的过程中起着关键作用。两种内质网驻留蛋白——蛋白二硫键异构酶A3（PDIA3）和钙联蛋白（CANX）——已成为蛋白质质量控制和钙稳态的关键调节因子。蛋白二硫键异构酶（PDIs）是一类多功能分子伴侣，通过氧化还原过程调控蛋白质二硫键（?S?S?键）的异构化并调节多种蛋白质功能（Mahmood等，2021）。PDIA3又称ERp57，是一种硫氧还蛋白氧化还原酶，具有广泛的分布和功能，可促进新生糖蛋白的二硫键形成，通常与凝集素伴侣钙联蛋白和钙网蛋白协同发挥作用（Chamberlain等，2019）。作为蛋白二硫键异构酶的PDIA3和作为内质网伴侣的CANX，在内质网内的蛋白质折叠和质量控制中均发挥重要作用（Ellgaard和Helenius，2003；Coe等，2010）。钙联蛋白（CANX）是一种I型跨膜伴侣蛋白，它使错误折叠的糖蛋白滞留在内质网中，并与PDIA3协调作用，确保蛋白质在内质网输出前正确折叠（Paskevicius等，2023）。CANX是一种内质网膜蛋白，其N端结构域位于内质网腔内，C端结构域延伸入胞质。钙联蛋白通常被认为是一种分子伴侣，参与膜结合蛋白和分泌蛋白的折叠及质量控制（Kozlov和Gehring，2020）。除了其在蛋白质折叠中的经典作用外，PDIA3和钙联蛋白均与钙信号有关。PDIA3可能通过其硫氧还蛋白结构域影响内质网膜上Ca2?通道和泵的活动（Mahmood等，2021）。研究表明，PDIA3通过与钙联蛋白和钙网蛋白相互作用，间接调节肌浆/内质网钙ATP酶（SERCA）活性，从而影响内质网钙储存（Venkatesan等，2021）。CANX含有一个低亲和力、高容量的Ca2?结合结构域，可在内质网内充当Ca2?储存蛋白（Schrag等，2001）。钙联蛋白本身可通过其腔内结构域结合钙，并被认为是一种钙传感器，将蛋白质折叠效率与内质网钙水平联系起来（Li等，2025）。这种微妙平衡的破坏通常导致内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR）的激活，而病毒常利用这一状态来创建有利于复制的环境。作为主要的细胞内钙储存细胞器，内质网在维持Ca2?稳态和应对病毒感染中起着核心作用（Zhou等，2009；Hyser和Estes，2015）。在静息状态下，内质网腔维持着高钙浓度，在内质网膜两侧形成陡峭的浓度梯度，使其成为病毒操纵的关键靶点。病毒可以破坏内质网Ca2?平衡，激活多种Ca2?依赖性酶促反应，并增强Ca2?敏感转录因子的活性，从而重塑胞内环境以支持病毒复制（Zampese和Pizzo，2012）。在非洲猪瘟病毒（ASFV）和小儿麻痹病毒的感染中已观察到Ca2?失调现象，其中病毒蛋白直接调节Ca2?通道和泵，从而改变细胞Ca2?稳态（Wang等，2024；Agirre等，2002）。塞内卡谷病毒（Seneca Valley virus）主要依赖内质网Ca2?储存来完成其复制周期（Hou等，2025；Qu等，2024）。事实上，越来越多的证据表明PDIA3和钙联蛋白在病毒复制中发挥调节作用。例如，钙联蛋白可促进流感血凝素和HIV包膜蛋白等病毒糖蛋白的折叠和组装。对于流感血凝素而言，钙联蛋白促进其折叠、延迟寡聚化并在微粒体中抑制其降解（Hebert等，1996）。在HIV感染中，病毒蛋白Nef增强钙联蛋白与HIV包膜糖蛋白gp160之间的相互作用，从而促进HIV包膜蛋白的成熟（Hunegnaw等，2016；Adzhubei等，2018）。研究表明，PDIA3可通过自噬-溶酶体途径调节包括埃博拉病毒糖蛋白在内的病毒糖蛋白的表达（Wang等，2022）。这些发现凸显了内质网伴侣在病毒生命周期中的重要性，特别是在确保对感染性和免疫逃逸至关重要的病毒蛋白正确成熟方面。与此同时，内质网钙释放也通过多种膜受体信号受到精细调控。成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）是受体酪氨酸激酶家族的成员，被激活后可直接启动PLCγ-IP?-Ca2?信号通路，从而触发内质网钙释放（Ornitz和Itoh，2015）。FGFR4主要通过三条经典通路发挥作用：调节细胞增殖的RAS-MAPK通路、调节细胞存活的PI3K-AKT-mTOR通路，以及PLCγ-PKC-Ca2?通路（该通路将PIP?水解生成肌醇三磷酸（IP?）和二酰甘油（DAG））。随后IP?与内质网膜上的IP?受体结合，导致钙库释放。这一机制将FGFR4与钙稳态直接联系起来，提示FGFR4可能在病毒感染中发挥重要作用。尽管已有上述认识，但PDIA3和钙联蛋白在脑心肌炎病毒（EMCV）复制中的作用仍知之甚少。EMCV是一种无包膜RNA病毒，属于小RNA病毒科，已知可诱导内质网应激以支持其复制（Xie等，2024）。然而，PDIA3和钙联蛋白是否通过其在蛋白质折叠、钙调控或内质网应激调节中的作用来促进EMCV复制，尚未得到系统性研究。在此，我们采用分子生物学与免疫学方法相结合的策略——包括siRNA介导的基因敲低、亚细胞分级、钙成像和病毒滴度测定实验——来阐明PDIA3和钙联蛋白在EMCV感染中的作用。我们的发现显示，这两种蛋白在EMCV感染期间均显著上调。此外，过表达PDIA3或钙联蛋白均可显著降低病毒滴度并破坏内质网钙稳态，表明这些伴侣蛋白不仅是病毒蛋白成熟的促进因子，也是EMCV利用以高效复制的钙依赖性信号通路的调节因子。综上所述，本研究首次提供了PDIA3和钙联蛋白是EMCV复制关键宿主因子的证据，凸显了其作为抗病毒干预新靶点的潜力。进一步探究EMCV与PDIA3/钙联蛋白之间这些潜在的相互作用，不仅将深化我们对病毒-宿主相互作用的理解，也将为开发靶向抗病毒策略提供新的见解。## 章节摘要### 细胞与病毒A549细胞使用F-12培养基（Cellmax，中国兰州）培养，并补充15%新生牛血清（NBS）（Minhai，中国兰州）。乳鼠肾-21（BHK-21）细胞使用DMEM（Cellmax，中国兰州）培养，并补充10%新生牛血清（NBS）（Minhai，中国兰州）。人心肌细胞（AC16细胞）使用DMEM培养，并补充10%胎牛血清（FBS）（Minhai，中国兰州）。所有细胞均在37℃、5% CO?的加湿培养箱中培养。EMCV株### EMCV感染使胞质Ca2?水平升高既往研究已表明，EMCV感染会诱发内质网（ER）应激。鉴于内质网是钙离子（Ca2?）——重要的信号分子——的主要细胞内储存库，且内质网应激是已知的钙稳态破坏因素（Makio等，2024），因此我们研究了EMCV感染是否会导致胞质Ca2?失调。我们在A549细胞中检测了EMCV感染期间的胞内Ca2?水平。为了直观观察EMCV之间的相关性### 讨论Ca2?是一种关键的细胞内第二信使，参与多种生理和病理过程，包括细胞增殖、能量代谢、信号转导、细胞死亡和免疫应答（Chen等，2019）。许多病毒劫持宿主钙信号以促进其吸附、进入、复制、组装和释放（Qu等，2022），而宿主细胞则通过检测异常的钙信号并激活免疫反应来启动抗病毒反应（Kong等，2021### 伦理声明本文不包含任何作者进行的人体或动物研究。### CRediT作者贡献声明**Hu Tianmei：** 监督、方法学。**Rong Lei：** 监督、方法学。**Cheng Chenyang：** 方法学。**Feng Ruofei：** 监督、资源、资金获取。**Xu Jiying：** 论文撰写——审阅与编辑。**Zhang Yaxin：** 论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿撰写、调查、概念构思。**Xie Jingying：** 论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿撰写、调查、数据整理。### 利益冲突声明作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。### 致谢本研究得到中央高校基本科研业务费（31920250002）、国家自然科学基金（32260037）、兰州市科技计划项目（2025-2-117）和甘肃省产学研融合科技项目赋能行动（25FNNA002）的资助。### 利益冲突作者声明无利益冲突。Yaxin Zhang|Jingying Xie|Tianmei Hu|Lei Rong|Chenyang Cheng|Ruofei Feng|Jiying Xu