荷兰犊牛溶血性曼氏杆菌致急性致死性多浆膜炎的发病机制：一项病例对照研究

《Veterinary Microbiology》：Pathogenesis of fatal acute polyserositis by Mannheimia haemolytica in Dutch veal calves: a case-control study

　　

溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica，M. haemolytica）是牛呼吸道疾病综合征（bovine respiratory disease complex，BRD）的主要病原体，但近年来在荷兰犊牛中出现了由其引起的急性纤维蛋白性多浆膜炎（polyserositis，PS），该病常于数小时至数日内致死。本研究旨在阐明M. haemolytica多浆膜炎的发病机制、病原在体内的播散范围及菌株克隆性，并评估相关风险因素。研究人员开展了一项前瞻性病例对照研究，纳入2022年1月至2023年2月间送检的634头犊牛中经病理确诊的53例M. haemolytica多浆膜炎病例及54头无多浆膜炎的对照犊牛。研究人员对多部位样本进行细菌学培养、多重PCR检测及全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）分析，并采用多元逻辑回归评估风险因素。结果显示，病例犊牛体内M. haemolytica广泛分布于多个器官，且以血清型A2为主（96%）；同一犊牛不同器官分离株基因高度一致（克隆性），提示病原经血行播散。支气管淋巴结与腹膜、咽后淋巴结与心包之间存在显著正相关（rho分别为0.44和0.48），支持下呼吸道作为入血门户。PCR检测显示94.0%病例犊牛支气管黏膜A2血清型阳性，而对照组仅8.5%。多因素分析表明，德国来源犊牛发病风险为荷兰来源的5.3倍（p<0.01），≤56日龄犊牛风险显著降低（OR=0.10，p<0.01），支气管黏膜多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P. multocida）阳性与发病风险增加3.8倍相关（p=0.04）。研究结论认为，M. haemolytica血清型A2特异性克隆菌株经下呼吸道侵入血流、不伴明显肺炎而播散至浆膜面，导致急性致死性多浆膜炎；德国来源、P. multocida共感染及较高日龄为风险因素。

《荷兰犊牛溶血性曼氏杆菌致急性致死性多浆膜炎的发病机制：一项病例对照研究》论文解读

一、研究背景与目的

溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica，M. haemolytica）是牛呼吸道疾病综合征（bovine respiratory disease complex，BRD）的主要病原体，通常与其他呼吸道病原体协同致病。在荷兰，M. haemolytica感染还与另外两种独特的疾病表现相关：奶牛急性纤维蛋白性胸膜肺炎（pleuropneumonia，PP）和犊牛急性纤维蛋白性多浆膜炎（polyserositis，PS）。多浆膜炎以胸膜、心包或腹膜炎症为特征，但很少累及其他浆膜部位（如脑膜和滑膜）。在犊牛中，若未及时给予适当的抗生素治疗，多浆膜炎常在数小时至数日内致死。该病约15年前在荷兰出现，发病率高峰在到达犊牛场后第9周，晚于BRD典型的第3周发病高峰。由于M. haemolytica被认为是主要呼吸道病原体，两种疾病发病年龄的差异引发疑问：M. haemolytica相关性多浆膜炎究竟是BRD的并发症，还是一个具有独立发病机制和入侵门户的独立疾病实体？

既往研究表明，荷兰犊牛多浆膜炎与血清型A2特异性相关，而奶牛PP与血清型A1或A6密切相关。这与传统观点——A2为非毒力共生血清型、定植于牛上呼吸道——相矛盾。在比利时和新西兰，犊牛中曾报道由多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P. multocida）引起的类似（多）浆膜炎暴发。此外，猪的格拉瑟病（Gl?ssers disease）由副猪格拉瑟菌（Glaesserella parasuis）引起，该菌与M. haemolytica同属巴斯德菌科（Pasteurellaceae），且同样影响年幼未断奶个体，病理表现相似。

目前关于M. haemolytica多浆膜炎的发病机制和风险因素的报道仍然匮乏。本研究旨在评估M. haemolytica在个体病例体内的存在和播散程度，评估犊牛体内分离株的克隆性，阐明病原体的入侵门户及呼吸道或其他器官系统的参与情况，并将潜在风险因素（如其他主要呼吸道病原体的存在和犊牛特征）与对照组进行比较。

二、研究设计与方法概述

研究人员在荷兰开展了一项前瞻性病例对照研究。皇家GD（Royal GD，前身为GD Animal Health）作为国家牛健康监测计划的一部分，每年对约600头送检犊牛进行尸检以确定死因。在2022年1月至2023年2月间送检的634头犊牛中，研究人员选取了53头由M. haemolytica引起的多浆膜炎犊牛（病例组）和54头无多浆膜炎的犊牛（对照组）。病例纳入标准包括：病理诊断为M. haemolytica引起的急性多浆膜炎、来自注册犊牛场、1至8月龄、有有效身份标识及犊牛和来源农场的元数据。对照组纳入标准相同但明确无多浆膜炎。病例的最终确认以发炎浆膜面细菌培养为纯M. haemolytica培养为准。

研究人员对病例犊牛的多处发炎浆膜（腹膜、胸膜和/或心包）、鼻腔、左右主支气管黏膜、小脑、脾脏、腭扁桃体及咽后、支气管和肠系膜淋巴结进行细菌学培养采样。对照组犊牛从相同部位采样（除浆膜外），另增加气管黏膜样本。分离株通过MALDI-TOF MS鉴定。支气管黏膜样本采用多重PCR检测9种常见牛呼吸道病原体，包括牛呼吸道合胞病毒（BRSV）、副流感病毒3型（PI3）、牛冠状病毒（BCoV）、M. haemolytica血清型A1/A6、A2、睡眠嗜组织菌（Histophilus somni）、P. multocida、牛支原体（Mycoplasma bovis）和D型流感病毒（InfDV）。此外，气管拭子检测牛疱疹病毒1型（BHV1），脾脏样本检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）。全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）采用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore）平台，以M. haemolytica D153菌株（NC_021743）为参考进行比对和变异检测，通过SNP分析评估菌株克隆性和遗传多样性。

三、研究结果

3.1 研究人群特征

研究期间共对634头犊牛进行尸检，其中81头犊牛有大体病理多浆膜炎诊断并按方案采样。经初始培养后，53头犊牛符合全部纳入标准成为病例。其余28头大体多浆膜炎犊牛培养结果为大肠杆菌（E. coli，n=14）、P. multocida（n=1）、Staphylococcus cohnii（n=1）、Staphylococcus capitis（n=1）或培养阴性（n=11）。共纳入54头对照。107头犊牛来自70个犊牛场。病例组平均尸检日龄82.2天（中位数82天，范围30-126天），对照组平均74.7天（中位数69.5天，范围26-170天）。病例组主要来自荷兰（43.4%）或德国（45.3%）农场，对照组主要来自荷兰（63.0%）。两组均以雄性为主（86.8% vs 85.2%）。死亡前数日内接受抗生素治疗的比例在病例组为45.3%、对照组为42.6%。

3.2 尸检发现

大体尸检发现，病例犊牛较少处于差体况（1.89% vs 22.2%），而更多处于中等体况（37.7% vs 20.4%），差异显著。浆膜中仅胸膜、心包或腹膜显示以纤维蛋白性渗出为特征的急性炎症。多数病例腹膜（86.8%）和胸膜（90.6%）均发炎，心包炎发生频率较低（58.5%）。脑脊膜和滑膜在所有病例中均未受累。32.1%（n=17）的病例有肺炎体征，其中15.1%为卡他性（支气管）肺炎，9.4%为化脓性支气管肺炎，1.9%为慢性支气管肺炎，5.7%（n=3）为M. haemolytica引起的纤维蛋白性出血性或坏死性胸膜肺炎。对照组中24.1%（n=13）有肺炎体征。对照组主要死因包括沙门氏菌感染（27%）、非感染性原因（37%）等。

3.3 细菌学结果

共进行1,015次培养，其中479次（病例437次，对照42次）M. haemolytica阳性。病例犊牛多数器官均检出M. haemolytica，表明感染广泛播散全身。腹膜、胸膜和心包样本阳性率最高（因纳入标准所致）。心包培养阳性率高于大体心包炎检出率。对照组中腭扁桃体M. haemolytica阳性率最高（22.2%），病例组腭扁桃体阳性率（54.7%）高于对照组但低于病例组其他所有采样器官。经Bonferroni校正后，两个显著相关：支气管淋巴结与腹膜（rho=0.44）及咽后淋巴结与心包（rho=0.48）。

3.4 PCR结果与多元逻辑回归分析

支气管黏膜PCR显示，94.0%病例A2血清型阳性，对照组仅8.5%；A1/A6血清型在病例中占4.0%，对照组占23.4%。仅2%病例和4.3%对照两种血清型均阳性。回归分析显示，德国出生犊牛发生M. haemolytica多浆膜炎的可能性是荷兰出生犊牛的5.3倍（p<0.01）。≤56日龄犊牛发病风险显著低于较大日龄犊牛（OR=0.10，p<0.01）。支气管黏膜P. multocida PCR阳性的犊牛发病风险增加3.8倍（p=0.04）。其余8种BRD病原体与多浆膜炎无显著关联。病例状态与肺炎的大体或组织病理学体征无关，与性别无关。所有犊牛气管拭子BHV1阴性，2份脾脏样本（1例病例、1例对照）BVDV ELISA和PCR均阳性。

3.5 全基因组测序结果

从125个选定分离株中获得104个序列（25头病例犊牛）和21个序列（10头对照犊牛）。分离株分为A1（n=21）和A2（n=104）两种血清型，组间SNP差异平均约10,121个，组内多样性有限：A1分离株最大差异355个SNP，A2分离株最大差异129个SNP。15个A1分离株来自7头对照犊牛，6个A1分离株来自2头病例犊牛；6个A2分离株来自3头对照犊牛，98个A2分离株来自24头病例犊牛。96%（n=24）的病例犊牛感染A2血清型，其中1头犊牛（F27_NL6666）同时检出A1和A2：3个克隆性A2分离株来自胸膜、支气管淋巴结和脾脏，2个克隆性A1分离株来自鼻腔和咽后淋巴结，该病例无肺炎体征。另1头病例犊牛（F5_DK0369）仅有克隆性A1分离株，未在腹膜和脾脏检出，该犊牛同时有纤维蛋白性胸膜肺炎和都柏林沙门氏菌（Salmonella Dublin）败血症。同一犊牛内A2分离株基本一致，仅2头犊牛存在1个（F3_NL0372）或2个（F21_4341）SNP差异。对照组中70%仅检出A1，30%仅检出A2。来自同一农场的不同犊牛间存在克隆性A2菌株传播的证据：Farm 21的两头犊牛携带10个克隆性A2分离株，Farm 25的两头犊牛各有4个克隆性A2分离株但基因型不同。

四、讨论与结论总结

讨论部分要点

研究最显著的发现是M. haemolytica血清型A2在急性致死性多浆膜炎犊牛体内广泛克隆性感染。脾脏样本中仅检出A2而非A1，表明A2具有经菌血症播散的独特倾向。同一犊牛不同器官分离株基因一致，强烈提示从单一入侵位点经血行播散并继发感染浆膜面。感染的克隆性及相对较少的SNP差异，结合多浆膜炎病例比例的增加，不支持多浆膜炎是多种细菌在易感因素存在下机会性入侵的结果，而提示特异性致病A2菌株的参与。同一农场两头病例感染相同A2菌株，且A2分离株总体遗传多样性低而A1多样性较高，提示致病性牛源A2菌株固有遗传变异有限，其出现可能反映宿主适应。

支气管黏膜PCR显示病例A2高流行而对照以A1/A6为主，提示对活体动物早期检测具有潜在诊断价值。A1与A2存在的负相关提示可能的竞争或抑制性相互作用。M. haemolytica多浆膜炎与P. multocida存在显著正相关，但肺炎与多浆膜炎无关联，排除肺炎动物后该关联更强，提示该关联独立于肺炎，值得进一步研究。支气管淋巴结与腹膜培养阳性显著正相关支持病原从下呼吸道经血行播散。尽管扁桃体过度生长可能是替代来源，但病例扁桃体阳性率相对低于支气管淋巴结，提示下呼吸道是入血的主要门户。A2在病例下呼吸道频繁存在但常无支气管炎症或肺炎病理体征，与A2相比A1诱导有限且延迟的炎症反应的体外数据一致，提示A2可在不引起明显呼吸道疾病的情况下经呼吸道入血。

较年轻犊牛发生多浆膜炎的可能性较低，与既往报道的约9周龄发病高峰一致。病例体况优于对照，可能反映多浆膜炎的急性性质，但也可能与年龄正相关及脂质代谢差异有关。德国来源犊牛发病风险显著升高，不能用过度代表解释，可能原因包括来源牛群中存在特定M. haemolytica基因型或接触其他未识别风险因素。

结论部分翻译

这项病例对照研究为犊牛M. haemolytica多浆膜炎发病机制的多个方面提供了见解。研究结果揭示了M. haemolytica血清型A2菌株的克隆性，这些菌株可能经血行播散至多个器官，并特异性诱导腹膜、胸膜和心包炎症，导致急性致死性多浆膜炎。结果表明，M. haemolytica通过下呼吸道侵入血流而不诱导肺炎，从而引起败血症。已确定的风险因素包括细菌遗传特征、宿主德国来源以及与P. multocida的共感染。进一步研究应聚焦于血清型A2毒力因子和宿主相关风险因素，这些连同年龄和脂肪代谢的潜在作用，为旨在改善生物安全和免疫调控的未来研究提供了方向，最终有助于更好地控制这一危害性疾病。