热灭活牛分枝杆菌（M. bovis）与卡介苗（BCG）免疫诱导非洲水牛实验性感染前免疫应答的研究

《Transboundary and Emerging Diseases》：Immune Responsiveness Induced by Administration of Heat-Inactivated M. bovis and BCG Prior to Experimental Infection in African Buffalo

　　

非洲水牛（Syncerus caffer）是非洲牛结核病（bovine tuberculosis, BTB）的主要野生储库动物。受感染的牛群在保护区内将BTB传播给众多物种，并在公园边界传播给家牛。BTB的检疫要求使野生种群集合管理复杂化。针对BTB的家牛和本地野生动物疫苗接种作为附加控制策略引起了极大关注。本先导试验旨在评估针对BTB免疫的非洲水牛的细胞介导和体液免疫应答。将21头亚成年非洲水牛分为四个处理组，分别接受肌内注射卡介苗（BCG；10⁶ CFU）、肌内注射热灭活牛分枝杆菌疫苗（HIMB-IM；10⁷ CFU；4个月后加强免疫）或口服热灭活疫苗（HIMB-O；10⁷–10⁸ CFU），或肌内注射1 mL磷酸盐缓冲液（PBS；对照组）。免疫后7个月，所有动物经气管内攻毒M. bovis（2 × 10⁵ CFU）。每月进行Bovigam干扰素-γ（IFNγ）试验和M. bovis特异性ELISA，此外，在研究开始和实验感染后5个月结束时进行比较皮内结核菌素试验（CITTs）。在整个研究期间，每个处理组表现出不同的细胞介导反应，其强度和时相动力学各异。在免疫后阶段，HIMB-IM动物在加强免疫后产生牛-禽纯化蛋白衍生物（PPD）IFNγ释放的强烈增加，而HIMB-O和BCG组阳性反应数量相对较少。实验性感染在所有处理组中引发了牛-禽PPD IFNγ释放的显著升高。所有动物均转为牛结核菌素反应阳性。在感染后早期，两个HIMB组均显示出比BCG和对照组更强的IFNγ反应，提示其具有更优的免疫启动。抗体反应表现出显著的个体差异、非结核分枝杆菌（NTM）物种的间歇性干扰以及较低的检测敏感性和特异性。

本研究旨在评估热灭活牛分枝杆菌疫苗（HIMB）和卡介苗（BCG）在非洲水牛（Syncerus caffer）中诱导的免疫应答，并比较其与未免疫对照的差异，同时考察免疫对结核病诊断试验的影响。非洲水牛是非洲牛结核病（bovine tuberculosis，BTB）最主要的野生维持宿主。受感染的牛群能将M. bovis传播给保护区内多种野生动物以及公园边界的家牛，造成生态和经济损失。BTB的检疫要求限制了野生种群的管理和迁移，因此疫苗免疫被视为一种有前景的补充控制策略。理想的野生动物疫苗需具备单次接种、低成本、无需冷链且对非靶标动物安全等特点。BCG虽然能降低病变严重程度和细菌载量，但会引起皮肤试验阳性反应且需冷链运输。HIMB疫苗已在野猪、獾、鹿和牛中显示有效，且无需冷链，但其在非洲水牛中的免疫原性尚不清楚。此外，非结核分枝杆菌（NTM）暴露可能干扰免疫应答和诊断结果。因此，研究人员开展了此项先导试验，以比较HIMB（肌注和口服）与BCG在非洲水牛中的免疫应答及对诊断试验的影响。

研究人员将21头亚成年非洲水牛分为四组，分别接受肌注BCG（10⁶ CFU）、肌注HIMB（10⁷ CFU，4个月后加强）、口服HIMB（10⁷–10⁸ CFU）或肌注磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照。免疫后7个月，所有动物经气管内攻毒M. bovis（2×10⁵ CFU）。每月采集血液进行干扰素-γ（IFNγ）释放试验和M. bovis特异性ELISA，并在研究开始和结束时进行比较皮内结核菌素试验（CITT）。结果显示：HIMB-IM组在免疫后阶段产生强烈的IFNγ反应，而HIMB-O和BCG组阳性反应较少；攻毒后所有组IFNγ显著升高，所有动物转为牛结核菌素反应阳性；在感染后早期，两种HIMB组的IFNγ反应均强于BCG和对照组，提示其具有更优的免疫启动效应。抗体反应个体差异大，且受NTM干扰，检测敏感性和特异性较低。研究结论认为，HIMB-IM免疫可诱导强细胞介导免疫，HIMB（肌注和口服）在感染后产生M. bovis特异性（ESAT-6）细胞介导反应，可能具有保护潜力，但需病理学和微生物学证据进一步确认。

研究样本来源于南非夸祖鲁-纳塔尔省Phinda和Manyoni保护区的24头7–15月龄自由放养非洲水牛，最终21头完成试验（3头死于寄生虫感染）。主要技术方法包括：比较皮内结核菌素试验（CITT），用于评估迟发型超敏反应；Bovigam IFNγ释放试验，使用牛源和禽源PPD、重组ESAT-6蛋白及多种NTM PPD刺激全血，检测细胞介导免疫；M. bovis特异性抗体ELISA（IDEXX）评估体液免疫；实验性攻毒采用气管内注射M. bovis野外分离株SB0130（2×10⁵ CFU）。统计使用R软件，包括Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验、Friedman检验和ANOVA等。

**(1) 围场适应、体况和胸围测量**：3只动物因寄生虫感染死亡，样本量减至21。所有动物在圈养初期体况下降，但随后恢复；实验感染后胸围持续增加，体况在感染后2个月（MP09）达峰后下降。这提示实验性感染影响了动物的机体状况。

**(2) 比较皮内结核菌素试验**：移动前所有动物CITT阴性。在试验终止时（MP12），除HIMB-O组两头牛被归为禽反应器外，其余均为牛反应器。CITT反应在组间无显著差异，但HIMB-IM组平均皮肤肿胀程度最低，而对照组和HIMB-O组最高且变异最大。中央坏死在52%的动物中出现，HIMB组发生率较低。

**(3) IFNγ释放试验**：在免疫后阶段（MA01–MA07），HIMB-IM组IFNγBOV–AV阳性检出率（64%）显著高于HIMB-O（11%）、BCG（0.3%）和对照组（0.9%）。HIMB-IM在加强免疫后一个月出现峰值。实验感染后，所有组IFNγBOV–AV显著升高；在感染后早期（MP08–MP09），HIMB-IM和HIMB-O组反应强于BCG和对照组，且ESAT-6特异性IFNγ反应也以HIMB组峰值为先。后期（MP10–MP12）对照组反应显著高于免疫组，提示免疫组可能控制了细菌增殖。

**(4) 非结核分枝杆菌引起的IFNγ反应**：在MA07，所有组对M. avium、M. fortuitum和M. nonchromogenicum PPD均出现强烈IFNγ反应，其中HIMB-IM和BCG组幅度最大。BCG组在MA01对M. avium有早期反应。HIMB-O组对M. nonchromogenicum的反应最为显著，而对照组在感染后对M. nonchromogenicum反应增强。

**(5) M. bovis特异性抗体**：对照组抗体阳性率（43.8%）高于免疫组（25%–29.2%）。所有处理组的平均S/P比值在感染后呈双峰模式，个体差异显著。三个动物在感染前MA07出现异常高S/P比值（>10），可能与NTM交叉反应有关。

**(6) 免疫对诊断试验的影响**：通过计算检验特异性，在免疫后未感染阶段，BCG组对IFNγ试验和ELISA的干扰最小，而HIMB-IM组IFNγ特异性最低（46.3%）。在感染后阶段，HIMB-O组的CITT敏感性降低（66.7%），但IFNγ试验敏感性为100%；ELISA敏感性普遍较低。

**(7) 试验结果之间的相关性**：BCG组中抗体反应与IFNγBOV–AV存在良好正相关（R=0.894），而对照组IFNγBOV与抗体呈强负相关（R=-0.980）。攻毒前的抗体峰值与NTM IFNγ反应有中度相关，表明NTM暴露可能干扰免疫应答。

讨论指出，HIMB-IM免疫诱导的IFNγ反应表明疫苗能有效激活细胞免疫。感染后早期HIMB组的快速ESAT-6反应可能源于疫苗中含有ESAT-6等抗原，而BCG缺乏该基因，这或与更好的疾病控制相关。后期对照组持续升高的IFNγ反应可能代表更高的细菌载量和疾病进展。口服HIMB免疫很少引起免疫后反应，但感染后能快速启动特异性反应，且对诊断试验干扰小，因此是野外应用的有力候选。抗体检测的低反应性可能与物种交叉反应性低及NTM干扰有关。本研究的局限性包括样本量小、动物年龄非疫苗接种最佳年龄等，但结果仍表明HIMB疫苗具有潜在保护价值。

本先导试验旨在研究通过肌内和口服给予HIMB后非洲水牛在实验性感染前的细胞和体液免疫反应。HIMB-IM免疫在感染前诱导了强烈的细胞介导反应。在感染后阶段，与对照组和BCG组相比，HIMB-IM和HIMB-O均产生了M. bovis特异性（ESAT-6）细胞介导反应，这可能与BTB病变严重程度降低相关。虽然HIMB免疫的细胞介导反应提示保护性反应，但仍需进一步的病理学和微生物学调查来确定观察到的免疫反应是否与保护相关。后续报告将涉及细菌载量和肺及淋巴结病变的数量与严重程度。