《Translational Oncology》：Cell-free DNA fragmentomics and epigenomic profiling in hematologic malignancies: current evidence, translational limitations, and future directions
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证据图谱将直接血浆研究从间接支持中区分出来。片段组学与表观基因组学信号可能补充突变检测。谱系相关甲基化不能确定恶性分数。多模态分析通常需要分开检测并进行整合。多数应用仍需独立前瞻性验证。液体活检已成为癌症诊断和疾病监测日益重要的组成部分。然而，在血液系统恶性肿
证据图谱将直接血浆研究从间接支持中区分出来。片段组学与表观基因组学信号可能补充突变检测。谱系相关甲基化不能确定恶性分数。多模态分析通常需要分开检测并进行整合。多数应用仍需独立前瞻性验证。液体活检已成为癌症诊断和疾病监测日益重要的组成部分。然而，在血液系统恶性肿瘤中，血浆并非完全肿瘤来源。恶性与非恶性造血细胞均贡献无细胞DNA（cell-free DNA, cfDNA），血浆谱受血细胞更新、治疗效应及细胞类型特异性染色质组织影响。因此，基于突变的分析可能受检测变异细胞来源不确定性的限制，尤其当同一基因在血液系统恶性肿瘤和克隆性造血中均发生改变时。克隆性造血是潜在混杂的重要来源，年龄相关克隆常携带DNMT3A、TET2和ASXL1等基因改变。片段组学和表观基因组学发现应在可行时使用配对白细胞或细胞对照、连续采样，并与肿瘤相关基因组、临床、影像或组织学证据整合。未来液体活检研究不仅应评估存在哪些基因组改变，还应评估结构和表观遗传cfDNA特征能否提供来源细胞身份和生物学状态的额外信息。片段组学、5hmC和DNA甲基化测量可能补充突变分析，特别是在受克隆性造血或混合造血cfDNA贡献影响的情境中。然而，这些方法不能独立确立恶性来源，其增量临床价值需要前瞻性验证。本综述的新颖性在于跨四个维度结构化比较cfDNA片段组学、DNA甲基化和5hmC：生物学信息、支持性生物标本的直接性、检测兼容性和验证成熟度。研究人员区分直接疾病特异性血浆研究与组织、细胞DNA、跨疾病和方法学证据，并识别临床解释超出可用数据之处，提出假设生成性的样本水平整合框架，纳入等分样本要求、测序深度、检测失败、批次效应、缺失模态和跨平台协调。目的不是引入临床可用检测，而是定义未来前瞻性研究必须满足的证据和技术要求。
论文解读：
研究背景与问题：液体活检在血液系统恶性肿瘤诊断和疾病监测中日益重要，但血浆并非完全由肿瘤来源cfDNA构成。恶性与非恶性造血细胞均向血浆释放cfDNA，血浆图谱受血细胞更新、治疗效应和细胞类型特异性染色质组织影响。基于突变的检测可能因变异细胞来源不确定而受限，尤其同一基因改变可见于血液系统恶性肿瘤和克隆性造血。年龄相关克隆常涉及DNMT3A、TET2和ASXL1等基因，若无配对白细胞分析或其他正交证据，低频率循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）信号解释可被背景造血凋亡、治疗诱导克隆选择或既存克隆性造血干扰。因此，需要系统区分直接血浆证据与间接支持，明确片段组学、DNA甲基化和5hmC等表观遗传信号能否补充突变检测，以及其转化限制和验证要求。
研究内容与意义：研究人员开展结构化叙述性综述，比较cfDNA片段组学、DNA甲基化和5hmC在血液系统恶性肿瘤中的生物学信息、生物标本直接性、检测兼容性和验证成熟度，区分直接疾病特异性血浆研究与非血浆、细胞DNA、跨疾病和方法学证据，并提出假设生成性的样本水平整合框架。结论是这些模态多可补充突变分析，但不能独立确定恶性来源，多数应用仍为回顾性、概念验证或假设生成，需独立前瞻性验证。
方法概述：研究人员检索PubMed/MEDLINE、Embase、Scopus和Web of Science至2026年7月24日，检索词组合cfDNA或ctDNA与fragmentomics、nucleosome positioning、fragment-end features、DNA methylation、5-hydroxymethylcytosine、measurable residual disease和hematologic malignancies。优先纳入评估血浆或血清cfDNA的原始人类研究；组织、细胞DNA、脑脊液、非血液和方法学研究仅作间接证据。采用五级证据框架：Level 1直接证据独立或前瞻验证，Level 2直接证据研究内验证，Level 3直接概念验证，Level 4间接血液证据，Level 5基础或假设生成。样本队列来源包括Singapore Chinese Health Study巢式病例对照、axi-cel治疗复发/难治性大B细胞淋巴瘤队列、DLBCL、AML和多发性骨髓瘤等血浆cfDNA队列。关键技术包括浅全基因组测序、超低覆盖全基因组测序、EPIC-seq、cfMeDIP-seq、5hmC-Seal或nano-hmC-Seal、TAPS、单链连接文库和纳米孔测序等。
研究结果：
文献检索策略与证据分类框架：该综述基于多数据库检索，将纳入研究分为五级描述性证据水平，用于证据映射而非正式GRADE评估或临床推荐。
片段组学：死亡细胞的结构语言。大小分布与窗口保护评分：细胞凋亡并非随机，cfDNA片段化记录核酸酶逻辑和释放时染色质结构；窗口保护评分（Windowed Protection Score, WPS）用于量化片段跨越或断裂于基因组窗口，使血浆DNA可被解读为核小体占据代理。多发性骨髓瘤162例新诊断患者中，超低覆盖全基因组测序估计血浆cfDNA肿瘤分数，并与
18F-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（
18F-FDG PET/CT）和临床结局比较，较高ctDNA分数与骨旁和髓外受累及较差无进展生存相关，但该研究未直接验证片段组学生物标志。末端基序与锯齿末端结构：末端基序指片段端点核苷酸序列，可能反映核酸酶偏好、染色质可及性、来源细胞组成和细胞死亡过程；淋巴瘤研究将末端基序频率与片段大小、拷贝数和蛋白特征联合用于检测或结局预测，但单个末端基序不应视为通用肿瘤特异标志。锯齿末端结构是天然双链cfDNA末端突出的单链区域，常规双链文库制备的末端修复可修改或掩盖该结构，Jag-seq等可估计天然单链突出；基础血浆研究主要来自妊娠、肝细胞癌、核酸酶缺陷模型和系统性红斑狼疮，而非血液系统恶性肿瘤，因此其诊断、预后或监测价值需疾病特异性验证。由cfDNA推断的核小体定位：EPIC-seq将启动子片段化熵与转录起始位点近端核小体缺失区覆盖结合，从cfDNA推断基因表达；在12例DLBCL验证队列中，血浆cfDNA衍生的细胞起源分数与RNA定义的生发中心B细胞样和活化B细胞样分类一致，但小队列且无独立外部验证，仅为概念验证。
CAR-T细胞治疗中的片段监测：STEP研究中，Sworder et al.分析axi-cel治疗复发/难治性大B细胞淋巴瘤的超过700份纵向标本，发现队列65例、验证队列73例，同时量化血浆ctDNA、cfCAR19和cfTCR，cfCAR19测量追踪CAR-T细胞扩增和持久性，cfCAR19片段长度差异提示较短分子可能部分来自组织暴露的CAR-T细胞，较长片段更接近循环细胞；该研究支持纵向肿瘤和效应细胞分析的研究级验证，但未建立常规临床效用或复发预测阈值。
5-羟甲基胞嘧啶作为情境依赖的表观遗传信号：5hmC由TET介导5mC氧化生成，常富集于增强子和基因体，但不是通用或直接基因激活标志；血浆cfDNA 5hmC反映混合细胞来源，并受肿瘤负荷、TET活性、克隆性造血、细胞更新、疾病相关表观重塑、检测化学和测序富集影响。TET2连接：既是混杂因素也是机会：TET2是造血细胞5hmC形成关键介质，TET2突变又常见于克隆性造血和髓系肿瘤，因此全局5hmC降低可能反映白血病生物学、年龄相关克隆性造血或二者，不能独立分配恶性来源。淋巴恶性肿瘤中的5hmC：48例新诊断DLBCL前瞻性单中心研究中，5hmC-Seal衍生的29基因加权预后评分与无事件生存和总生存相关，并在同队列提供额外预后信息，但无独立外部验证；73例新诊断DLBCL和滤泡淋巴瘤中，四基因panel区分DLBCL与滤泡淋巴瘤，测试集AUC为88.5%，联合年龄和性别AUC为91.7%，但模型开发和测试均在同一小队列；86例DLBCL中，R-CHOP前血浆cfDNA 5hmC 13特征逻辑回归模型内部验证集AUC为0.78，敏感性0.82，特异性0.75，但小验证集且无外部队列；176例参与者中，DLBCL与健康对照的十标志物模型内部验证AUC为0.94，敏感性83%，特异性87%，但对照为健康人且无外部验证。潜在药效学应用：依鲁替尼可改变慢性淋巴细胞白血病细胞染色质组织，BTK抑制期间ctDNA水平和克隆组成改变，但尚无研究直接验证血浆cfDNA 5hmC用于监测BTK通路抑制、治疗反应或耐药，因此该应用为假设生成。
用于来源细胞推断和疾病分类的DNA甲基化：DNA甲基化可支持来源细胞推断，但基于参考的去卷积主要估计参考细胞群体相似性或比例贡献，不应自动解释为恶性分数；在血液肿瘤中，恶性与正常细胞可能来自同一谱系并共享谱系相关甲基化特征。混合cfDNA信号的解卷积：CelFEER和MetDecode等计算方法主要基于模拟和非血液或主要为实体瘤队列，未直接验证白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤中同一谱系恶性与正常造血细胞的区分。急性白血病中基于甲基化的监测和分类的间接细胞DNA证据：Bo?i? et al.分析15例AML患者34份诊断和随访样本、34例NPM1突变AML患者83份血样及63名健康供者外周血DNA，AML相关甲基化模式可区分诊断AML与健康对照，但甲基化评分不能可靠区分MRD阳性与阴性，部分MRD阴性样本仍检测到异常甲基化，提示克隆性造血相关改变；2025年研究基于2540份诊断样本建立DNA甲基化急性白血病分类器，并用纳米孔测序评估临床骨髓、外周血或心包液细胞标本，25/26例回顾预测与常规诊断一致，5例前瞻分析一致，但未分析血浆cfDNA。肿瘤组织甲基化研究和T细胞淋巴瘤分类的可能性：外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、T滤泡辅助细胞谱系淋巴瘤和部分PTCL-NOS的组织甲基化研究提示表观遗传亚群，但证据主要来自组织、细胞、临床前模型或非cfDNA，未建立血浆cfDNA亚型分类。
互补cfDNA特征的潜在整合：不同cfDNA模态提供部分不同信息，计算组合在部分概念验证队列中改善分类或癌症信号检测，但尚未建立普遍适用的恶性与非恶性造血贡献区分方法。假设生成性整合框架：研究人员提出样本水平整合框架，不假设5mC、片段组学和5hmC的固定顺序，而根据疾病、临床目标、肿瘤负荷、血浆输入、检测设计和参考数据决定；5mC去卷积支持来源或谱系推断，但不能独立确定恶性分数，片段组学提供片段大小、末端、核小体和染色质信息，5hmC提供情境依赖表观信息。检测兼容性和血浆输入分配：三种模态技术上不同，但若建库化学保留天然末端，片段大小、末端结构和CpG甲基化原则上可从同一测序文库获得；然而许多当前流程仍需分开等分样本，低cfDNA浓度或低肿瘤负荷患者中样本分配会降低各模态信息分子数。测序深度和分析成本：全基因组片段组学可能需要广覆盖和较深测序，甲基化和5hmC对CpG覆盖、富集或转化效率、独特分子数和测序深度要求不同；多模态增加成本、失败率、数据存储和计算需求，成本效果尚未确立。数据整合策略：区分分子水平多模态获取、特征水平整合、样本水平整合和模型水平整合；本综述框架主要为样本水平，后续可采用特征或模型水平计算整合，不声称在同一分子上分配5mC、5hmC和片段组学信号。
技术考虑和预分析陷阱：cfDNA表观基因组学对采血后处理速度、血浆分离和采集化学高度敏感；EDTA最经济但需快速处理，Streck管延长处理窗口并抑制白细胞裂解，但可能有甲醛交联伪影；cfMeDIP-seq适合低输入但为富集检测，返回相对而非绝对碱基水平甲基化；TAPS为无亚硫酸氢盐碱基分辨率方法，但标准TAPS同时读取5mC和5hmC，需TAPSβ或CAPS等区分；片段组学在降解或低产量血浆中受益于单链连接建库；锯齿末端分析需报告末端修复酶、连接策略和计算定义，不同建库流程结果不可直接比较。计算工具包括FinaleDB、cfDNAPro、cfTools等，但尚无单一平台整合片段组学、5mC、5hmC和单倍型甲基化。
未来方向与未解问题：纳米孔测序目前应视为研究性分子水平获取平台，而非经验证整合cfDNA检测；表观遗传调用准确性依赖孔化学、碱基和修饰调用模型、覆盖、CpG密度、基因组背景和软件版本；低输入血浆中5hmC与5mC稳健区分仍未充分标准化。输入、深度、重复性和成本仍是主要转化限制；一项可行性研究中4 mL血浆cfDNA建库，来源细胞去卷积在约0.2×基因组覆盖较稳定，0.05×及以下降解，但此为研究特异观察。原发中枢神经系统淋巴瘤脑脊液5hmC分析仍是未测试转化机会；血浆片段组学能否反映淋巴瘤微环境状态需配对血浆-组织研究；阿扎胞苷治疗相关表观重塑如何共同影响血浆cfDNA片段组学和5hmC仍未知。研究人员认为未来主要机会在于将片段组学与甲基化、羟甲基化、核小体定位及临床或基因组信息整合为可生物学解释框架，并在独立多中心队列验证；cfDNA片段组学是有前景的补充工具，但尚非独立诊断方法。
讨论与结论翻译：基于突变的液体活检仍是血液系统恶性肿瘤诊断和疾病监测的重要组成部分。然而，血浆变异的解释可能因克隆性造血、治疗相关造血改变和非恶性血细胞贡献而复杂化。这些局限并不使突变检测根本上不充分，但强调在特定情境下需要配对细胞对照、适当临床背景和互补生物标志物。片段组学、5hmC和DNA甲基化分析是有前景的补充方法，可能提供单独突变分析未捕获的结构和表观遗传信息。片段组学特征可能反映染色质组织、核酸酶活性和来源细胞组成。回顾性概念验证研究表明cfDNA 5hmC可能有助于淋巴瘤分类、治疗反应评估和AML可测量残留病评估。DNA甲基化分析可能支持来源细胞或谱系推断，但疾病分类证据目前主要来自方法学、跨癌种、组织或细胞DNA研究，而非直接疾病特异性血浆验证。这些模态均不能独立确定恶性来源，大多数报道应用仍为回顾性、概念验证或假设生成。多模态整合可能通过结合部分不同的cfDNA特征改善解释，但目前应视为概念和研究性框架，而非经验证临床工作流。片段组学、5mC和5hmC测量通常需要分开检测，其最佳组合、分析顺序和计算整合仍不确定。前瞻性研究应确定整合模型是否比基于突变的检测和已建立的流式细胞术、影像、组织和临床方法提供可重复获益。未来开发需要严格预分析标准化、透明计算验证、独立重复和临床相关前瞻终点。结构和表观遗传cfDNA分析可能拓展液体活检的生物学信息，支持在选定血液系统恶性肿瘤中进行更具情境感知的解释，而非取代突变分析。
