单细胞转录组与免疫微环境分析揭示TIMP1相关的OLFM4?肿瘤上皮程序与结直肠癌进展及免疫逃逸的关联

《Translational Oncology》：Single-cell transcriptomic and immune microenvironment analyses reveal a TIMP1-associated OLFM4? tumor epithelial program linked to colorectal cancer progression and immune evasion

单细胞转录组与免疫微环境分析揭示一种与TIMP1相关的OLFM4?肿瘤上皮程序，该程序与结直肠癌进展及免疫逃逸相关联 单细胞分析鉴定出结直肠癌中一种干样OLFM4?细胞状态。OLFM4?细胞表现出代谢活性，并在癌组织中富集。成纤维细胞来源的WNT2B信号可能靶向OLFM4?上皮细胞。一种基于OLFM4?衍生的风险评分能够反映预后及免疫差异。TIMP1敲低可抑制结直肠癌细胞生长、迁移和侵袭。 研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，描绘了结直肠癌进展过程中正常结直肠黏膜、腺瘤及癌组织样本的细胞景观和肿瘤上皮多样性。通过推断恶性特征并重新聚类肿瘤上皮细胞，研究人员鉴定出一个具有干样特性和代谢活跃表型的C3 OLFM4?肿瘤上皮亚群。该亚群在癌组织中的代表性高于腺瘤组织，提示其可能与结直肠癌进展相关。研究人员进一步结合分化轨迹、功能程序、细胞间通讯及转录因子调控网络分析，旨在明确该亚群的生物学特征及其与结直肠癌进展、代谢重编程和肿瘤微环境（TME）相互作用的关联。研究人员还构建了OTRS模型，并评估了其与患者预后、免疫微环境特征及潜在治疗反应的关联。最后，研究人员优先对TIMP1进行功能验证，并通过体外实验检测了其对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。总体而言，研究结果在单细胞分辨率下定义了结直肠癌正常–腺瘤–癌进展序列中的关键恶性上皮细胞状态，并支持进一步探索高风险进展机制、预后分层及精准治疗评估。

结直肠癌进展与免疫逃逸的细胞基础：OLFM4?肿瘤上皮亚群的单细胞解析与TIMP1功能验证

一、研究背景与科学问题

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球消化道最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的重要贡献者。根据GLOBOCAN 2022年估计，CRC约占全球新发癌症病例的9.6%和癌症相关死亡的9.3%，发病率和死亡率分别位居全球第三和第二位。散发性CRC是其主要形式，经典的腺瘤–癌序列被认为是散发性结直肠肿瘤发生的典型模型。既往研究已在基因组、表观基因组、转录组和蛋白质组水平上揭示了该序列中的一系列关键分子事件，包括APC/WNT信号异常、KRAS或BRAF激活、TP53失活、错配修复缺陷及微卫星不稳定等。

然而，CRC进展无法完全由线性突变驱动模型解释。在从癌前病变向癌转变的过程中，恶性上皮细胞经历广泛的异质性扩增，获得干样或可塑性细胞状态，适应代谢程序改变，并与重塑的肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）动态交互。特别是，在癌组织中较腺瘤组织更显著富集的上皮细胞状态，及其与代谢重编程、基质通讯、免疫逃逸相关特征和患者预后的关联，尚待系统定义。阐明这一问题对于理解CRC发生和进展的细胞基础至关重要，并可能有助于识别具有恶性潜力的高风险细胞状态，从而为预后分层提供依据。

在治疗方面，CRC目前依赖局部和全身综合手段，包括内镜干预、手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗。免疫检查点阻断在微卫星不稳定高或错配修复缺陷的CRC中显示出显著疗效，但微卫星稳定患者大多从免疫治疗中获益有限。治疗抵抗和疾病进展通常由肿瘤细胞内在异质性、代谢重编程、基质信号激活、免疫抑制性TME等因素驱动。因此，识别与CRC进展、免疫逃逸和异质性治疗反应相关的关键肿瘤上皮细胞状态，对于理解治疗失败的细胞基础并开辟预后分层和个体化治疗优化的新途径具有重要意义。

单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术能够在单细胞分辨率下表征CRC肿瘤发生和进展过程中的细胞状态多样性，区分不同疾病阶段的肿瘤细胞亚群，并表征其分化轨迹、代谢程序、转录调控特征及与基质和免疫细胞的相互作用。整合正常、腺瘤和癌组织的scRNA-seq分析，为系统描绘CRC正常–腺瘤–癌序列中的恶性上皮细胞状态转变及其与代谢重编程、基质信号和免疫微环境重塑的关联提供了机会。

二、研究设计与技术方法

研究人员从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）获取scRNA-seq数据（编号GSE161277），涵盖正常组织、腺瘤和肿瘤样本；从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库获取CRC患者的批量转录组谱及相应临床信息。质量控制后保留33,991个合格细胞，涵盖22,296个检测基因。主要技术方法包括：使用Seurat和Harmony进行数据处理、批次效应校正和聚类；通过inferCNV推断拷贝数变异（copy number variation, CNV）以鉴定恶性细胞；利用Monocle、Slingshot和CytoTRACE进行分化轨迹和干性分析；采用CellChat分析细胞间通讯；使用pySCENIC推断转录因子调控网络；通过LASSO Cox回归构建预后风险模型；采用CIBERSORT、ESTIMATE和TIDE评估免疫景观和治疗反应；最终通过体外实验验证TIMP1功能。

三、主要研究结果

1. 结直肠组织中主要细胞类型的鉴定

经质量控制、批次校正、降维和聚类，共鉴定出八种主要细胞类型，包括上皮细胞、T/NK细胞、B细胞、浆细胞、髓系细胞、肥大细胞、成纤维细胞和内皮细胞。通过inferCNV分析，研究人员将恶性上皮细胞进一步分为九个亚型：C1 ASCL2?、C2 CD74?、C3 OLFM4?、C4 MUC2?、C5 MKI67?、C6 PRAC1?、C7 CHGA?、C8 BEST4?和C9 POU2F3?。C3 OLFM4?亚型表现出相对较高的nCount_RNA、nFeature_RNA和细胞干性AUC值，以及较低的CNV评分。组织分布分析显示，C1 ASCL2?在腺瘤组织中占主导，而癌组织表现出更多样的亚型组成。Ro/e分析表明，C3 OLFM4?肿瘤上皮细胞在癌组织中较腺瘤组织更富集，提示其可能代表一种与进展相关的上皮状态。

2. CRC肿瘤上皮亚型的富集分析

功能富集分析揭示了各亚型的独特生物学特征。C3 OLFM4?亚型与细胞内定位、代谢重编程和端粒维持高度相关。基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示，C3 OLFM4?亚型与谷胱甘肽代谢过程密切相关。基因本体论生物学过程（GO-BP）富集分析表明，C3 OLFM4?亚型在蛋白质折叠、有氧呼吸和氧化磷酸化方面显著富集。代谢通路分析显示，C3 OLFM4?亚型在氧化磷酸化、谷胱甘肽代谢、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢和柠檬酸循环方面表现出更强的富集，提示其具有代谢活跃的细胞状态。

3. 分化轨迹与干性分析

CytoTRACE分析显示，C3 OLFM4?亚型具有较高的干性评分，而C4 MUC2?亚型干性潜力相对较弱。干性相关基因如CTNNB1、PROM1、MYC和HIF1A在C3 OLFM4?亚型中显著表达。Monocle拟时序分析显示，C3 OLFM4?细胞位于推断轨迹的早期至中间过渡区域。Slingshot分析表明，谱系1–3在早期分化阶段汇聚于C9 POU2F3?和C5 MKI67?亚型，随后经过C3 OLFM4?亚型后分化为不同的终末状态，提示C3 OLFM4?亚型可能是细胞分化过程中的关键过渡群体。

4. 细胞间通讯与信号通路调控网络分析

CellChat分析显示，C3 OLFM4?亚型与成纤维细胞的相互作用强于其他细胞类型。信号网络分析确定WNT信号是成纤维细胞与C3 OLFM4?肿瘤上皮细胞之间的主要通讯途径。在WNT信号网络中，成纤维细胞主要作为信号发送者和影响者，而C3 OLFM4?肿瘤上皮细胞是主要接收者。配体–受体分析显示，WNT2B配体在成纤维细胞中富集，而经典WNT受体FZD5、FZD6、LRP5和LRP6主要在C3 OLFM4?肿瘤上皮细胞中表达，支持成纤维细胞来源的WNT2B–FZD/LRP配体–受体相互作用的预测。

5. C3 OLFM4?亚型的转录因子调控网络分析

转录因子层次聚类将调控子分为两个主要调控模块。C3 OLFM4?亚型在M2模块中优先富集。该亚型的前五位调控因子为XBP1、NFIA、PPARG、HDAC2和UBE2K。

6. OLFM4?肿瘤细胞风险评分的构建与验证

将C3 OLFM4?亚型的前100个标记基因进行单变量Cox回归和LASSO回归，鉴定出五个预后基因：TIMP1、BST2、SPINK1、SERPINA1和LGALS4。多变量Cox回归估计各基因的回归系数后构建OTRS模型。高风险组患者预后较差，Kaplan–Meier生存分析显示高风险组总生存期（overall survival, OS）显著缩短。时间依赖性受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析显示，1年、3年和5年预测的曲线下面积（area under the curve, AUC）值均超过0.6。相关性分析表明，TIMP1和BST2与OTRS正相关、与OS负相关，而SPINK1、SERPINA1和LGALS4呈相反模式。Kaplan–Meier分析显示，BST2、LGALS4、SERPINA1和TIMP1的表达水平与OS显著相关。列线图分析表明，OTRS在OS预测中作出突出贡献。

7. OTRS与肿瘤免疫微环境和预后的关联

CIBERSORT分析显示，高风险组和低风险组之间在七种推断的免疫细胞群体中存在显著差异。TIDE算法用于推断潜在免疫治疗反应。药物敏感性预测通过pRRophetic包完成。

8. TIMP1的功能验证

在HCT116和SW480结直肠癌细胞系中通过小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）实现TIMP1的瞬时敲低。细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8, CCK-8）实验、集落形成实验和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine, EdU）掺入实验评估细胞增殖能力，Transwell实验评估迁移和侵袭能力。结果显示，TIMP1敲低可抑制结直肠癌细胞的生长、迁移和侵袭。

四、研究结论与意义

本研究在单细胞分辨率下系统描绘了CRC正常–腺瘤–癌进展序列中的恶性上皮细胞状态转变，鉴定出C3 OLFM4?肿瘤上皮亚群这一具有干样特性和代谢活跃表型的进展相关细胞状态。该亚群在癌组织中富集，处于分化轨迹的过渡位置，接受成纤维细胞来源的WNT2B信号，并受XBP1、NFIA、PPARG、HDAC2和UBE2K等转录因子调控。基于该亚群标记基因构建的OTRS模型能够有效反映患者预后和免疫微环境差异，为预后分层提供了潜在工具。TIMP1作为OTRS中的关键不利预后基因，其敲低在体外实验中抑制了CRC细胞增殖、迁移和侵袭，提示其可能作为潜在的治疗靶点。这些发现为理解CRC进展的细胞基础、识别高风险细胞状态以及探索精准治疗策略提供了重要参考。