整合网络药理学、单细胞测序与机器学习揭示天麻素靶向NFE2L3、UBE2S、CA9、CCNB1和CFD并调控肿瘤免疫微环境抗结直肠癌的机制

《Translational Oncology》：Network pharmacology and single-cell sequencing analysis of gastrodin in anticancer effects against colorectal cancer by regulating key target genes and the tumor immune microenvironment

多组学（multi-omics）分析在结直肠癌（colorectal cancer, CRC）中鉴定出5个天麻素（gastrodin）相关枢纽基因（hub genes）：NFE2L3、UBE2S、CA9、CCNB1和CFD。SHAP（SHapley Additive exPlanations）分析确定NFE2L3为核心基因中的主导诊断特征。单细胞测序（single-cell sequencing）显示NFE2L3/UBE2S在上皮细胞（epithelial cells）中富集，而CA9/CCNB1表达与成纤维细胞（fibroblasts）相关。核心枢纽基因与免疫浸润（immune infiltration）密切相关，包括活化CD4⁺ T细胞（activated CD4⁺ T cells）、效应记忆CD8⁺ T细胞（effector memory CD8⁺ T cells）和M2巨噬细胞（M2 macrophages）。沉默（silencing）NFE2L3可抑制结直肠癌细胞的恶性表型（malignant phenotypes）并促进凋亡（apoptosis）。

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是消化系统常见恶性肿瘤，全球发病率居第三、死亡率居第二。尽管手术切除、化疗、放疗和免疫治疗等不断发展，CRC患者尤其是晚期患者的5年生存率仍不理想，因此寻找高效低毒新型治疗药物并阐明其作用机制具有重要意义。天麻素（gastrodin，4-hydroxybenzyl alcohol-β-d-glucoside）是从Gastrodia elata Blume干燥块茎中提取的天然活性单体，具有镇静催眠、抗焦虑、认知改善、抗炎、抗氧化和神经保护等药理活性，并在肝癌、肺癌和乳腺癌中显示抗肿瘤潜力，可抑制恶性细胞增殖和细胞周期进程、诱导凋亡并抑制肿瘤血管生成。但其在CRC中的作用尚未系统阐明，对特定靶基因和肿瘤免疫微环境（tumor microenvironment, TME）的调控仍待研究。网络药理学（network pharmacology）可系统筛选药物靶点并预测作用通路；单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）可在单细胞水平解析TME细胞组成和功能状态；机器学习可用于筛选核心靶基因和疾病亚型分类。现有研究多聚焦图像诊断、通用抗癌药筛选、药物组合预测或非CRC肿瘤，天麻素与网络药理学、bulk转录组、单细胞定位、免疫微环境分析、分子对接和体外验证在CRC中的整合仍不充分。基于此，研究人员整合上述方法系统探索天麻素抗CRC机制，筛选潜在靶点和核心枢纽基因，分析免疫微环境和不同CRC亚型，进行分子对接并开展实验验证，以期为天麻素临床应用提供理论和实验基础。

研究人员开展的研究得出，5个核心枢纽基因为NFE2L3、UBE2S、CA9、CCNB1和CFD；NFE2L3在SHAP模型中贡献最高；天麻素可与5个核心靶蛋白结合，其中与CCNB1结合能最低；核心枢纽基因与免疫细胞浸润相关；基于核心基因的共识聚类将CRC分为C1和C2亚型；NFE2L3沉默可抑制CRC细胞恶性表型并促进凋亡。该研究为天麻素抗CRC机制和精准治疗提供了候选靶点与实验依据。

主要关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用网络药理学预测天麻素靶点；使用GEO数据库5个CRC转录组数据集GSE21510、GSE32323、GSE41258、GSE81558、GSE87211合并队列（265例正常组织、552例CRC组织），并纳入TCGA-COAD和TCGA-READ数据；采用GSE200997 scRNA-seq数据；收集中山市人民医院5对CRC组织及配对癌旁正常组织；使用HCT116、SW620、SW480、LoVo、HT-29和HCoEpiC细胞系。分析技术包括GSVA、WGCNA、DEG、GO/KEGG、LASSO、SVM、随机森林、SHAP、Seurat/Harmony、ssGSEA、CIBERSORT、ConsensusClusterPlus、AutoDock Vina分子对接，以及siRNA、qRT-PCR、CCK-8和Transwell实验。

结果部分如下。Screening of potential targets of gastrodin and CRC-related genes：从数据库获得786个天麻素潜在靶点，去重后628个；TCGA中筛选4857个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），其中2778个上调、2079个下调；合并GEO数据集中筛选3397个DEGs，其中1720个上调、1677个下调。GSVA score analysis of gastrodin-related gene sets：基因集变异分析（gene set variation analysis, GSVA）显示，CRC样本中天麻素相关基因集评分显著低于正常样本，提示其下调可能与肿瘤发生和进展相关。Screening of key modules by WGCNA：加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）在合并GEO数据中构建网络，软阈值power为4时满足无标度网络特征，共得到12个模块；黄色模块与天麻素GSVA评分相关性最高（r = ?0.42，P < 0.001），被选为后续分析模块。Screening of common target genes and functional enrichment analysis：将628个天麻素潜在靶点、312个CRC相关DEGs和1245个WGCNA黄色模块基因取交集，得到15个共同靶基因；基因本体（Gene Ontology, GO）富集涉及内质网分子伴侣复合物、内质网内蛋白折叠、未折叠蛋白反应和蛋白折叠调节等，京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集涉及细胞周期、p53信号通路和TGF-beta信号通路等。Screening of core hub genes by machine learning：LASSO回归筛选出12个非零系数基因，支持向量机（support vector machine, SVM）在纳入13个基因时预测准确率最高（0.98），随机森林筛选出7个Gini重要性评分>20的基因；三种机器学习方法交集得到5个核心枢纽基因：NFE2L3、UBE2S、CA9、CCNB1和CFD。Analysis of core hub gene importance by the SHAP model：SHAP模型显示核心基因重要性排序为NFE2L3 > CFD > UBE2S > CA9 > CCNB1，NFE2L3平均SHAP值最高（0.202）；NFE2L3、UBE2S、CA9和CCNB1表达与其SHAP值正相关，CFD表达与其SHAP值负相关；5基因模型在训练集和验证集中的曲线下面积（area under the curve, AUC）均>0.98。Expression of core hub genes analyzed at single-cell resolution：scRNA-seq分析注释出17个细胞簇，归为T细胞、NK细胞、B细胞、上皮细胞、浆细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、杯状细胞、内皮细胞、周细胞和肥大细胞等11种细胞类型。Validation of differential expression of core hub genes in CRC tissues：CA9在上皮细胞中相对高表达，CCNB1和CFD在成纤维细胞中最高表达，NFE2L3在肥大细胞中平均表达最高且上皮细胞中升高，UBE2S在多种细胞中表达且NK细胞中最高；NFE2L3、UBE2S、CA9、CCNB1和CFD在CRC组织中较正常组织显著上调（P < 0.001）。Immune cell infiltration analysis：ssGSEA显示CRC组织中活化B细胞、活化CD4⁺ T细胞、效应记忆CD8⁺ T细胞和调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）浸润评分显著升高，而naive B细胞、naive CD4⁺ T细胞和NK T细胞显著降低；NFE2L3与活化CD4⁺ T细胞和Tregs正相关，UBE2S与效应记忆CD8⁺ T细胞正相关，CA9与M2巨噬细胞正相关，CCNB1与活化B细胞正相关，CFD与中性粒细胞负相关。Consensus clustering analysis of CRC subtypes：基于5个核心枢纽基因的共识聚类将CRC分为C1和C2两个亚型；C1中活化B细胞、活化CD4⁺ T细胞和效应记忆CD8⁺ T细胞评分高于C2；PCA显示PC1解释47.15%的方差；C2中CA9和CCNB1表达较高，C1中CFD、NFE2L3和UBE2S表达较高；GSVA显示C2中乙醛酸和二羧酸代谢、甘油磷脂代谢、酪氨酸代谢评分较高，C1中赖氨酸降解、柠檬酸循环（citrate cycle, TCA cycle）和泛素介导蛋白水解评分较高。Molecular docking of gastrodin and core targets：分子对接（molecular docking）显示天麻素与5个核心靶蛋白均结合良好，结合能均<0 kcal/mol；CCNB1结合能最低（?8.1 kcal/mol），其次为UBE2S（?6.7 kcal/mol）、CFD（?6.3 kcal/mol）、CA9（?5.4 kcal/mol）和NFE2L3（?5.1 kcal/mol），结合方式主要涉及氢键和疏水相互作用。Validation of the biological function of NFE2L3 in CRC cells：5对CRC组织中NFE2L3 mRNA显著高于配对癌旁正常组织（P < 0.01），多种CRC细胞系中NFE2L3也高于正常结肠上皮细胞HCoEpiC，选择SW480和HCT116进行后续实验；si-NFE2L3成功敲低NFE2L3后，SW480和HCT116细胞活力显著降低（P < 0.001），SW480细胞迁移和侵袭能力显著受抑制（P < 0.01或P < 0.001）。

讨论部分总结：CRC发生发展涉及多基因和多通路，传统单靶点研究难以全面阐明其发病和药物机制。研究人员认为天麻素可能通过调控5个核心枢纽基因和TME发挥抗CRC作用。NFE2L3属于碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP）转录因子家族，参与细胞应激、氧化还原平衡及肿瘤发生发展，在肝癌中可激活Wnt/β-catenin通路促进增殖转移，在乳腺癌中调节上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）；本研究中NFE2L3在CRC高表达且为SHAP最重要核心基因，分子对接提示其可与天麻素稳定结合。UBE2S是泛素-蛋白酶体系统关键酶，调节细胞周期和DNA损伤修复，在CRC等肿瘤中高表达并与不良预后相关；本研究显示其高表达并与效应记忆CD8⁺ T细胞浸润正相关，且与天麻素结合能较低。CA9在缺氧时上调，调节细胞内外pH以促进肿瘤细胞生存和侵袭，是肿瘤缺氧标志；本研究显示CA9高表达并与M2巨噬细胞浸润正相关，提示其可能促进缺氧和免疫抑制微环境。CCNB1是G2/M期转变关键调节因子，与CDK1（cyclin-dependent kinase 1）形成复合物促进G2→M进展；本研究显示CCNB1高表达且主要位于成纤维细胞，分子对接中与天麻素结合最强。讨论还引用RNA干扰Hotair或LSD1降低心肌细胞增殖和心肌再生的非恶性肿瘤模型，提示抗增殖效应可能影响正常组织修复，未来需评估正常组织反应，但未确立Hotair或LSD1为天麻素CRC介质。CFD是补体替代途径关键酶，参与免疫炎症和TME调节，在卵巢癌中可促血管生成，在黑色素瘤中影响巨噬细胞极化；本研究显示CFD高表达并与中性粒细胞浸润负相关，且可与天麻素结合。免疫微环境方面，CRC组织中活化B细胞、活化CD4⁺ T细胞和效应记忆CD8⁺ T细胞升高，而naive B细胞和naive CD4⁺ T细胞降低，提示免疫激活和免疫耗竭并存；核心基因与促肿瘤免疫细胞浸润相关，CFD与抗肿瘤免疫细胞浸润负相关，天麻素可能通过下调核心基因、减少促肿瘤免疫细胞并增加抗肿瘤免疫细胞浸润改善免疫微环境。C1亚型免疫浸润较高、核心基因表达较低，可能预后更好且更利于免疫治疗；C2亚型CA9和CCNB1高表达、免疫浸润低，可能对传统化疗或靶向治疗更敏感，为个体化治疗提供依据。讨论提出，CCNB1和CFD定位于成纤维细胞及TGF-beta信号富集提示癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast, CAF）和基质重塑途径；TGF-beta信号可导致T细胞排斥和PD-L1阻断反应降低，FAP阳性CAF来源CXCL12可阻止T细胞进入癌细胞区域，CAF还可分泌TGF-beta、IL-6、VEGF和CXCL12并产生细胞外基质限制效应T细胞浸润；CA9高表达与M2巨噬细胞正相关提示缺氧-酸性轴，缺氧驱动CA9和VEGF相关血管异常、酸性应激及髓系/Treg偏斜免疫条件；C2中活化B细胞、活化CD4⁺ T细胞和效应记忆CD8⁺ T细胞减少及造血谱系和原发性免疫缺陷相关通路富集提示免疫排斥可能涉及空间募集和免疫细胞状态重塑障碍。这些假设仍需趋化因子/细胞因子谱、空间免疫染色、基质扰动及天麻素处理CRC类器官或动物模型验证。局限包括：研究属于生物信息学分析，结果需体内外实验进一步验证；scRNA-seq样本量小，可能存在偏倚；天麻素与核心靶点相互作用及TME调控机制仍需探索。未来方向是将计算和初步实验框架推进为靶点导向的转化流程，在多中心独立CRC队列中验证5基因面板，开发标准化qRT-PCR、免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）或靶向转录组检测，开展剂量反应、患者来源类器官和体内肿瘤模型研究，并评估天麻素对NFE2L3和CCNB1的直接或间接调控及其对增殖、凋亡、EMT和免疫信号的影响；救援实验、功能获得和丧失实验、生化结合实验、药代动力学及安全性分析也需加强。研究人员强调该框架目前应视为研究阶段决策支持模型，而非可直接临床部署工具；未来可整合分子分型、类器官药敏、免疫状态评估和液体活检监测，如循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）监测，以支持个体化天麻素相关干预。安全性评价应伴随未来临床开发；Chokkakula等对FAERS中venlafaxine报告的分析提示报告偏倚和自发报告不能确立因果关系，支持前瞻性不良事件收集和药物警戒，但venlafaxine相关信号不能外推至天麻素。

结论部分翻译：本研究整合网络药理学、单细胞测序、机器学习和分子对接，系统探索天麻素抗CRC机制。NFE2L3、UBE2S、CA9、CCNB1和CFD这5个核心枢纽基因在CRC组织中高表达，并与肿瘤进展和不良预后相关。分子对接模拟中，天麻素与5个核心靶蛋白均结合，其中与CCNB1结合最强，提示CCNB1可能是天麻素在CRC中的关键靶点。核心枢纽基因主要表达于成纤维细胞、上皮细胞和免疫细胞，并与免疫细胞浸润密切相关。天麻素可能通过调控这些核心基因表达改善肿瘤免疫微环境。基于核心枢纽基因的共识聚类将CRC患者分为两个具有不同基因表达模式、免疫细胞浸润和通路富集的亚型，为个体化CRC治疗提供依据。本研究为天麻素在CRC治疗中的临床应用提供理论和实验基础，并为精准CRC治疗提供新策略和靶点。值得注意的是，研究人员将研究构建为定量筛选到验证框架：计算阶段通过阈值过滤和有监督学习指标定义候选基因，实验阶段用定量分子和细胞终点评估排名最高靶点的生物学相关性，该设计提高结果可重复性并适合后续外部验证和剂量反应实验扩展。从数值角度，本研究分析包含817例样本的整合bulk转录组队列（552例CRC组织和265例正常组织），筛选628个预测天麻素相关靶点，缩小至15个共同CRC相关靶点和5个机器学习定义枢纽基因；NFE2L3的SHAP贡献最高（平均SHAP值=0.202），5基因模型在训练集和验证集中AUC均>0.98；对接能范围为?8.1至?5.1 kcal/mol，CCNB1与天麻素结合最强（?8.1 kcal/mol）。免疫浸润分析中，NFE2L3与活化CD4⁺ T细胞（r = 0.32，P < 0.001）和Tregs（r = 0.28，P < 0.001）相关，UBE2S与效应记忆CD8⁺ T细胞相关（r = 0.35，P < 0.001），CA9与M2巨噬细胞相关（r = 0.25，P < 0.001），CCNB1与活化B细胞相关（r = 0.30，P < 0.001），CFD与中性粒细胞相关（r = ?0.22，P < 0.001）。机制上，免疫排斥相关高评分表型可能与CAF驱动基质重塑、TGF-beta/CXCL12和VEGF/缺氧相关信号以及M2巨噬细胞/Treg偏斜免疫抑制相关，但这些假设需功能验证。Yu等报道口服天麻素50 mg/kg每周三次共12周可通过抑制TLR4/MD2/NF-κB轴减轻AOM/DSS诱导的结肠炎相关肿瘤发生；Zhang等显示天麻素在10、20和40 μM剂量下通过SKP2/NCOA4通路诱导CRC细胞铁死亡。与这些机制聚焦研究相比，本研究整合大规模转录组筛选、单细胞定位、免疫微环境分析、共识聚类、分子对接和NFE2L3功能验证，提示天麻素可能通过肿瘤细胞内在靶点和免疫微环境相关机制发挥作用，而非单一通路。局限包括：结果部分依赖回顾性数据集和靶点预测数据库，极高诊断AUC需独立前瞻队列验证以排除数据集偏倚；临床验证样本仅5对CRC组织，单细胞数据集可能不能完全代表CRC患者间、解剖和分子异质性；未对枢纽靶点开展直接功能、剂量反应、生化结合和体内实验，因此预测相互作用应视为假设生成而非临床已确立；内部训练-验证划分、交叉验证和多算法比较提高了研究内可重复性，但未来仍需正式外部可重复性评估和bootstrap稳定性检验。